骨髓基质细胞成骨诱导过程中细胞因子及细胞外基质蛋白作用的研究进展

解 芳 滕 利

·综述·

骨髓基质细胞成骨诱导过程中细胞因子及细胞外基质蛋白作用的研究进展

解 芳 滕 利

目前，在骨组织工程研究中，各种细胞因子被广泛应用于促进骨髓基质细胞（Bone marrow stem cells，BMSCs）的增殖、分化以及诱导中。细胞因子的家族成员种类繁多，各自的功能也较复杂，而且彼此之间还存在着协同或拮抗的作用。如何更好地应用这些诱导物质，促进BMSCs向成骨细胞分化，本文就该问题综述如下。

1 概述

在细胞的增殖和分化过程中，有一系列的蛋白质起着关键作用。其中，一些是细胞自身分泌的（自分泌），另一些是通过邻近细胞分泌的（旁分泌），这些蛋白质称为细胞因子或生长因子。组织工程研究中常用的生长因子包括骨形成蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMP)、成纤维细胞生长因子（Fibroblastic growth factors，FGFs）、转化生长因子（Transformating growth factor-β，TGF-β）、胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor，IGF）等。它们能够影响BMSCs的增殖、分化，促进血管内皮细胞的分裂、增殖，并合成细胞外基质，最终促进骨的生成。目前，通过对生长因子及细胞外基质蛋白的研究，揭示BMSCs分化成骨的分子机制，并在此基础上探讨应用外源性生长因子和细胞外基质蛋白促进BMSCs向成骨细胞分化的可能和途径，已成为国内外学者研究的热点。

2 生长因子

2.1 骨形成蛋白

BMP已成为骨组织工程研究中最重要的生长因子之一，尤其是其中的BMP-2和BMP-7[1]。

有实验表明，对人BMSCs用重组人BMP-2（rhBMP-2）作用96 h后，不仅细胞碱性磷酸酶（ALP）值明显升高，细胞量也明显增多，与rhBMP-2浓度呈正相关。说明rhBMP-2对人BMSCs的增殖与成骨分化具有促进作用。Lecanda等[2]的研究证实，rhBMP-2能够提高人BMSCs及肋骨来源的成骨细胞内的ALP、骨钙素、Ⅰ型胶原mRNA的表达，但同时导致这两种细胞的增殖受到抑制。

多数学者认为，BMP-2具有促进BMSCs增殖的作用。陈富林等[3]观察了rh-BMP-2对培养的骨髓细胞生物学活性的影响，结果表明，低浓度的rhBMP-2（＜0.16 mg/L）对培养的骨髓细胞的ALP活性、蛋白质含量均有明显的促进作用，且呈剂量依赖性；而高浓度的rhBMP-2（＞0.16 mg/L）对培养的骨髓细胞的增殖有一定促进作用，这证实了BMP不仅促进骨髓细胞向成骨细胞的表型转化，而且可促进骨髓细胞的增殖。

有多项研究表明，rhBMP-2能明显提高BMSCs在骨组织缺损中的修复能力，被认为是骨缺损修复中生长因子应用的良好选择[4-7]。部分学者认为，BMP可以促进成骨细胞前体细胞向成骨细胞转化，但不能使其向成熟成骨细胞转化[8]。BMP在促进BMSCs向成骨细胞分化的同时，还可抑制其向其他细胞，如脂肪细胞、骨骼肌细胞等的分化。

BMP-6、BMP-7在体内外均有诱导骨源性干细胞分化的作用。转染BMP-7基因的BMSCs不仅可促进其自身向成骨细胞的定向分化，同时也能促使未转染的BMSCs的定向分化，最终获得干细胞来源的成骨细胞，满足组织工程研究中对种子细胞的要求[1]。Adeno-BMP7转染可促进BMSCs的体外成骨定向分化，转染后的BMSCs具有更强的体内成骨能力，可明显促进新骨的形成，与未转染的BMSCs相比，两者有显著差异[9]。

2.2 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）

bFGF是一种25 kD的多肽，包括至少19个密切相关的单肽。bFGF对BMSCs具有极强的促增殖作用。bFGF不仅能提高BMSCs的增殖速度和寿命，而且能在增殖过程中保留BMSCs的多向分化潜能。bFGF还被证实具有促进血管生成的作用，可在骨组织工程中促进血管向植入物中生长，以利于成骨细胞的生长[1]。

有些学者认为，bFGF能够促进细胞的贴壁和增殖，但对其分化成熟具有抑制作用。bFGF对成骨细胞分化作用不大，甚至可以阻止成骨细胞的分化。有研究发现，bFGF能有效促使未成熟的间质细胞分裂，如前软骨细胞、前成骨细胞，而对成熟的分化较好的成骨细胞作用较弱，甚至有研究认为它对分化好的成骨、软骨细胞有抑制作用，并抑制骨基质，如Ⅰ型胶原的合成[10]。但体内研究认为，bFGF能促进骨折愈合，防止骨不连[11]。

研究表明，bFGF和rhBMP联合应用，对人BMSCs的增殖和ALP活性的表达均有显著作用，其效应显著大于单一因子的作用[12]。但外源性bFGF、rhBMP-2、TGF-β等，由于半衰期短，需反复大剂量使用，且价格昂贵。因此，目前多采用基因转染方法促进人BMSCs表达生长因子，从而促进增殖、分化；或使用多种因子联合应用的序贯治疗，在序贯治疗时常先使用促进增殖的细胞因子，然后再使用促进矿化的生长因子。

2.3 转化生长因子-β

TGF-β是一族具有促进细胞增殖、调节细胞分化、促进细胞外基质合成的生长因子，对多种细胞具有促分化效应，是作用较强的促成骨分化的因子，能提高ALP的表达，并能减少和延迟BMSCs向脂肪细胞转化，从而提高BMSCs的成骨效应[1]。TGF-β可以显著提高软骨细胞表型，促进培养的软骨细胞表达多种类型的胶原和蛋白多糖[13]。TGF-β1被认为是促进MSCs形成软骨的必要条件，没有TGF-β1的情况下只产生很少量的葡萄糖胺聚糖。在体外培养状态下，TGF-β对乳鼠成骨细胞的作用是双向的。在低剂量下，在细胞密度达到近于汇合或高密度培养时，TGF-β明显地促进DNA合成，促进成骨细胞增殖；而当浓度高于15 ng/mL时，或细胞在低密度培养时，则使成骨细胞的DNA合成受到抑制。在无血清培养条件下，TGF-β促使BMSCs向软骨细胞转化。

TGF-β、BMP-2可刺激体外培养的骨祖细胞增殖，TGF-β作用强于BMP-2，尤其是对早期的骨祖细胞。TGF-β对BMSCs的作用与细胞分化程度有关，早期可促进增殖，晚期则促进分化，但是TGF-β在体内无骨诱导作用[14]。

2.4 胰岛素样生长因子

IGF是一种半生长激素依赖性多肽，是骨组织中含量最为丰富的生长因子，能够刺激骨细胞进行有丝分裂和分化，增加功能成熟的成骨细胞的数量和蛋白合成，在骨生成过程中,骨基质内IGF浓度明显增高[1]。

Thomas等[15]对具有双向分化潜能的hMS（3-4）的研究发现，IGF（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）能使细胞的增殖率增加2倍，但不改变CBFal、PPARZ（成骨细胞和脂肪细胞分化的调控因子）、ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素以及脂肪细胞系标志物脂蛋白脂肪酶Adipsin的表达；IGF明显刺激Ⅰ型胶原在分化后的hMS（3-4）细胞及成熟成骨细胞中表达，增加分化脂肪细胞中脂滴的含量。这说明，IGFs对骨髓间充质细胞的分化与细胞所处的分化阶段有关。

2.5 在各种细胞外基质蛋白中培养BMSCs

周江等[16]的研究表明，血管内皮细胞培养液提取液中含有多种生长因子，可以促进BMSCs向成骨细胞方向分化，与成骨诱导液效果相同。另外，孙源等[17]以BMSCs诱导内皮细胞（EC），使其能增强BMSCs的成骨活性，提高BMSCs的增殖能力。

骨细胞的培养液亦可用来促进BMSCs的成骨分化。Heino等[18]从骨细胞MLO-Y4的培养液中提取条件培养液，该培养液能促进BMSCs的增殖和向成骨细胞分化。Matsubara等[19]用从牛角膜内皮细胞中提取的类细胞外基质的基膜（b-ECM）上培养人BMSCs，结果显示其生长率、增殖期和多向分化潜能均较只用塑料培养瓶者增加，而且在第5代时其骨唾液蛋白和钙沉积的水平仍与第2代相当。Mauney等[20]用变性的Ⅰ型胶原基质培养BMSCs获得类似的结果，细胞传至11代时，钙沉积、碱性磷酸酶活性、骨唾液蛋白和碱性磷酸酶表达与第1代相比仍维持在69%～95%之间，而且还保留了某些常规培养条件下丧失的功能，如热休克蛋白70的表达等。

2.6 骨生长蛋白（OGP）

骨生长蛋白是新近发现的一种促骨形成因子，体内实验发现它能刺激骨形成，增加小梁骨的密度。体外实验则发现骨生长蛋白促进骨髓间充质细胞向成骨细胞的分化，但对其增殖作用则因种属而异。Robinson等[21]的实验表明，OGP可明显刺激兔和人骨髓间充质细胞的ALP活性及矿化结节形成，但抑制兔BMSCs的增殖，促进人BMSCs的增殖。

2.7 瘦素（Leptin）

研究表明，瘦素能够促进骨髓间充质细胞向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化。瘦素可使人骨髓间充质细胞系hMS2-12的矿化能力增强，矿化基质增加59%，成骨细胞ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素mRNA及蛋白质表达均明显增加；同时向脂肪细胞的分化减弱，脂肪细胞基因Adipsin和Leptin的mRNA表达下调，脂滴形成减少50%。但未发现Leptin对骨髓间充质细胞的增殖率有影响[22]。

2.8 甲状旁腺激素（PTH）

甲状旁腺激素对骨转化具有双向调节作用；大剂量给药时有促进骨吸收的作用；小剂量时则能促进成骨前体细胞分化为成骨细胞，发挥促进骨形成的作用[1]。Kuznetsov等[23]研究表明，PTHrP是骨髓间充质组织生长和骨骼干细胞隔间的主要调节因子。持续应用PTH将促进骨吸收、导致骨丢失，间断性小剂量应用PTH则促进骨形成、使骨量增加。Isogai等[24]将PTH作用于小鼠头盖骨成骨样细胞，低密度接种时，ALP活性呈剂量依赖性增高；而高密度接种则抑制了ALP活性及骨钙素表达。说明PTH对成骨细胞诱导分化与细胞接种密度及分化阶段有关。

2.9 雌激素和孕激素

雌激素可有效预防妇女绝经后骨质疏松的发生，E2和抗骨质疏松药物XW630可刺激成骨细胞的增殖活性[25]。17β-雌二醇可调节BMSCs向成骨细胞分化而减少其向脂肪细胞分化,并且可以抑制成骨细胞向脂肪细胞的横向分化[26]。Delhon等[27]研究表明，雌激素相关受体α参与了成骨分化过程，它的沉默可以促进成骨分化和钙沉积。

Shuanhu等[28]的研究，揭示了雌激素作用于雌激素受体α和雌激素受体b在BMSCs向成骨分化过程中发挥的作用不同，作用于前者时发挥正性的作用，而作用于后者时呈现负性作用。

孕激素对BMCSs有诱导作用，可增加细胞在体外培养时的矿化结节数量，刺激骨钙素的分泌，但其作用主要针对培养早期的BMCSs，因而其作用目前尚存在争议。

3 展望

在BMSCs向成骨细胞分化的过程中，多种细胞因子和细胞外基质起着重要的作用，目前的研究主要还集中在单一细胞因子的作用，对多种细胞因子的协同作用尚无定论，对于外源性细胞因子和细胞外基质作用的时间阶段和途径还需进一步探讨。相信随着BMSCs成骨分化的分子机制的深入研究，必将对临床应用和研究产生重要的指导意义，推动骨组织工程的进一步发展。

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1673－0364（2010）01－0049－03

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10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.015

卫生部临床学科重点项目（3030426-04）。

100144北京市中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院。