鱼腥草总生物碱提取工艺的研究

2010-02-05梁慧超孟江卢国勇李雪英

成都医学院学报 2010年4期

梁慧超,孟江,卢国勇,李雪英

(广东药学院中药学院,广州 510006)

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜Houttuynia cordata Thumb.的干燥地上部分及新鲜全草,是卫生部规定的药食两用的极具开发前途的资源之一,具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效,主要用于肺脓疡、痰热咳嗽、热痢热淋、痈疮肿毒的治疗[1]。鱼腥草所含生物碱主要有头花千金藤二酮(cepharadione B)、马兜铃酸内酰胺B(aristolactam B)、马兜铃酸内酰胺AⅡ(aristolactam AⅡ)和胡椒内酰胺(piperolactam A)等[2]。既往研究发现鱼腥草生物碱在体外对5种人肿瘤细胞株(A-549、SK-OV-3、SK-MEL-2、XF-498、HCT-15)具有一定的细胞毒作用[3]。课题组研究发现鱼腥草生物碱有效部位对Lewis肺癌瘤荷瘤小鼠实体瘤的生长具有很强的抑制率(论文待发表)。但目前对鱼腥草总生物碱的提取工艺研究未见报道。本实验以总生物碱含量、得率为指标,采用正交试验对鱼腥草总生物碱的提取工艺进行优选。

1 仪器与试药

UV-2450紫外分光光度计(日本岛津公司);RE5299型旋转蒸发仪(河南巩义市仪器厂);双B循环水式多用真空泵(SHB-IV,郑州长城科工贸有限公司)。GZX-9240 MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);超声波清洗机(上海博迅实业有限公司);电子天平(AY l20,SHAM AOZU CORPOPAIT ION JAPAN)。胡椒内酰胺(实验室自制,纯度大于98%);盐酸,乙醇,均为分析纯。鱼腥草采自广东省梅州市五华县,经广东药学院刘基柱副教授鉴定为三白草科蕺菜Houttuynia cordata Thunb.。

2 方法与结果

2.1 鱼腥草总生物碱含量测定方法的建立

对照品溶液制备：精密称取已恒重的胡椒内酰胺对照品适量,置50 m l容量瓶中,加95%乙醇定容,摇匀即得0.110 mg/m l的对照品溶液。供试液溶液的制备：精密称取鱼腥草1g,按正交设计表进行提取、过滤、浓缩得浸膏,称重计算得率;再将浸膏加95%乙醇定容至100 m l,再移取1 m l,定容至10 m l,摇匀,即得。最大吸收波长的选择：分别取对照品溶液、供试品溶液和乙醇空白溶液在200-800 nm范围扫描,结果发现胡椒内酰胺和样品液在276 nm都有最大吸收,且吸收峰相同,而空白对照液在276 nm处几乎没有吸收,故本实验选择276 nm为测定波长。标准曲线制作：精密移取对照品溶液0.0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 m l分别置于10m l容量瓶中,加95%乙醇定容,于276 nm处测定吸光度[A,旧称光密度(OD)]值,以A值为纵坐标,浓度C为横坐标,计算得回归方程A=109.78C-0.028,R2=0.9935,胡椒内酰胺在0.016 5～0.082 5 m g/m l浓度范围内与A值呈良好的线性关系。精密度试验：取对照品溶液于276nm处测定A值,连续测定6次,RSD为0.085%,表明精密性较好。稳定性试验：取供试液于276 nm处测定A值,每隔20m in测定1次,连续测定6次,结果在2 h内稳定,RSD为0.80%。重复性试验：称取鱼腥草自然干品6份,按供试品溶液制备方法制备样品溶液。测定A值,RSD为2.17%,表明重复性好。

2.2 鱼腥草总生物碱提取方法

回流提取法：称取鱼腥草3 g,加10倍体积95%乙醇,回流提取3次,每次1.5 h,过滤,浓缩得干浸膏,按供试样品溶液的配制项下操作,计算得率和总生物碱的含量,结果见表1。超声波提取法：称取鱼腥草3 g,加10倍体积95%乙醇,超声提取3次,每次1 h,过滤,浓缩得干浸膏,按供试样品溶液的配制项下操作,计算得率和总生物碱的含量,结果见表1。冷浸法：称取鱼腥草3 g,加10倍体积95%乙醇浸泡24 h,过滤,浓缩得干浸膏,按供试样品溶液的配制项下操作,计算得率和总生物碱的含量,结果见表1。冷浸-超声提取法：称取鱼腥草3 g,加10倍体积95%乙醇浸泡24 h后,超声提取30m in,离心,残渣同上再提取1次,合并上清液,过滤,浓缩得干浸膏,按供试样品溶液的配制项下操作,计算得率和总生物碱的含量,结果见表1。

表1 不同提取方法比较Tab.1 Comparing thedifferent extraction methods

从不同提取方法的实验结果发现,回流提取法所得的总生物碱的含量和得率都高于其它提取方法,因此确定回流提取法为最佳提取方法。

2.3 正交试验法优化鱼腥草总生物碱回流提取最佳工艺

制定因素水平表。以料液比、乙醇浓度、提取时间和提取次数为考察因素,每因素选取3个水平,进行L9(34)正交表安排试验[4-6]。以总生物碱得率及含量作为衡量提取效率的双重客观指标,优选最佳工艺。因素水平安排见表2,结果见表3。

加权法综合评价鱼腥草总生物碱提取工艺。最佳提取条件要满足总生物碱得率高并且含量也高,因此采用加权评分法综合评估鱼腥草总生物碱提取条件。评分标准为：将各项指标除以该列最大值再乘以100,为其该项得分。通过这样处理,使总生物碱得率和含量转化为0～100之间的数。根据总生物碱得率(x)和含量(y)的作用,而确定两者的权重系数分别为0.4和0.6,对两项指标进行加权求和,通过公式z=0.4x+0.6y,得到综合评分(z)[7]。加权评分结果及方差分析见表3、表4。

2.4 结果分析

从正交试验结果和方差分析表可知,因素B(乙醇浓度)对鱼腥草总生物碱提取有显著性影响,而因素A(料液比),因素C(提取时间)及因素D(提取次数)对鱼腥草总生物碱提取无显著性影响。由R得出影响因素大小顺序为B＞D＞A＞C,根据实际情况结合经济效益,C(提取时间)选择C2即2 h,最佳提取工艺为A1 B2 C2 D3,即料液比为1∶20,提取次数为3次,提取时间为2 h,乙醇浓度为85%。

表2 因素水平表Tab.2 Factor level

表3 正交试验及结果Tab.3 Orthogonal exper imentaldesign and results

2.5 验证实验

按照理论最佳工艺,进行重复实验,总生物碱含量和得率分别为7.23%,28.65%,与实验结果一致。

3 讨论

从表1可以看出,采用4种不同的提取方法进行提取,所得提取物生物碱含量和提取物得率的高低顺序均为：回流提取法＞冷浸-超声提取法＞超声波提取法＞冷浸法。冷浸法避免了加热,使其中的热敏性成分有了一定的安全性,但所用溶剂量均较大,提取时间较长,操作费时麻烦,提取效率最低。超声提取具有提取快速、安全,操作简单,节省时间和能源,提取率较高等优点,并且可以避免长时间高温加热所引起的物质的分解,适合于提取热不稳定成分,也是目前提取中药有效成分常用的一种方法。回流提取法无论生物碱得率还是含量都较高,因此选取回流提取作为鱼腥草生物碱最佳提取方法。