鼠输尿管完全梗阻后肾脏病理及足细胞表型改变的研究

于雪馨，王常林，孙荣国，杨屹

（中国医科大学 附属盛京医院1.小儿内科；2.小儿泌尿外科，沈阳 110004）

鼠输尿管完全梗阻后肾脏病理及足细胞表型改变的研究

于雪馨1，王常林2，孙荣国2，杨屹2

（中国医科大学 附属盛京医院1.小儿内科；2.小儿泌尿外科，沈阳 110004）

目的 观察鼠输尿管完全梗阻后肾脏病理和足细胞表型改变的时序变化，寻找输尿管梗阻后肾脏发生不可逆损伤的时相。方法 建立单侧输尿管完全梗阻动物模型，梗阻后不同时间点取出肾脏，经HE染色和免疫荧光双标方法，观察肾脏病理及足细胞表型的改变。结果 大体观察，梗阻24h后出现肾盂扩张，梗阻3d后出现肾皮质变薄。组织学观察，梗阻12h后出现一部分近曲小管扩张，小管上皮细胞呈水样变性肿胀，在梗阻3d后出现大量小管上皮细胞变形肿胀。免疫荧光双标法，梗阻24h后有少量足细胞、巨噬细胞同时被2种抗体标记，2d后足细胞呈减少趋势，而巨噬细胞逐渐增多。结论 输尿管梗阻后在肾脏病理改变早于肾脏发生形态学改变的发生，输尿管梗阻后24h发生足细胞表型的改变，与肾脏肾盂出现明显扩张的时间相近，随着梗阻时间的延长，肾脏病理改变逐渐加重，足细胞转化逐渐增多。

输尿管梗阻；足细胞表型；肾脏损伤

输尿管梗阻所致的肾积水是小儿泌尿外科常见的先天畸形。随着产前超声的广泛应用，胎儿及无症状新生儿肾积水诊断率大大提高，改变了以往因出现临床症状就诊手术的医学模式。这些无症状肾积水何时手术成为困扰临床医生的一大难题。诊断输尿管梗阻意味着肾脏会发生不可逆性损害，在肾脏发生不可逆损害前解除梗阻，才能挽救肾脏功能。肾脏何时发生不可逆损伤？是否存在肾脏发生不可逆损伤的时间点？据此，我们制作单侧输尿管完全梗阻的动物模型，在梗阻后不同时间点观察肾脏大体形态改变、镜下病理改变和肾脏足细胞表型改变时序变化。

1 材料与方法

1.1 材料

选用生后2周、2月SD大鼠（其肾脏发育程度分别相当于人类新生儿及儿童肾脏程度）。本研究在卫生部小儿先天畸形重点实验室完成，使用主要设备：光学显微镜，荧光显微镜。羊抗大鼠podocalyxin单克隆抗体。小鼠抗大鼠ED-1单克隆抗体，FITIC标记兔抗羊IgG，正常非免疫山羊血清，RODAMINE标记羊抗小鼠IgG。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制作：生后2周、2月SD大鼠各96只，随机分为梗阻组和对照组，每组又以梗阻后6h、12h、24h、3d、5d、7d各分为 6组，每组 8只。

实验组在输尿管上1/3近肾盂处，用双线结扎，中间离断。对照组，步骤同前，仅游离输尿管后不结扎。分别于术后 6h，12h，24h，3d，5d 和 7d 处死大鼠。取出双侧肾脏。

1.2.2 病理检查：测量各组肾脏大小及肾皮质厚度后，HE染色。光镜下观察肾病理病变。

1.2.3 免疫荧光双标：一抗为羊抗大鼠podocalyxin单克隆抗体和小鼠抗大鼠ED-1单克隆抗体，抗体滴度为1∶100，二抗为FITIC标记兔抗羊IgG1∶50和RODAMINE标记羊抗小鼠IgG1∶20。

1.2.4 在荧光显微镜下，观察足细胞特异性标记物podocalyxin和巨噬细胞特异性标记物ED-1的免疫荧光双标结果。每张切片取5个视野，将数字化图像储存于计算机，计数每高倍视野下，被红光和绿光标记的细胞数，应用ImageAnalysis程序进行图像分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0统计系统进行分析。组间比较采用配对t检验，各指标不同时间点的变化趋势用均数表示。

2 结果

2.1 大体观察结果

未见术后感染。10只2周龄大鼠术前状态差，不能耐受手术刺激而死亡，各组缺少样本均予以补充。余者术后3d逐渐恢复正常。梗阻24h后，出现肾盂扩张，随时间延长，肾盂扩张程度加重，梗阻3d后肾皮质逐渐变薄（图1）。

2.2 组织学观察结果

对照组肾脏未见异常，实验组随梗阻时间延长，肾小管间质损害进行性加重，12h后，近曲小管明显扩张，管腔扩大，小管上皮细胞呈水样变性改变；3d后，大量小管上皮细胞变性肿胀，导致管腔狭窄，形状不规则（图2）；7d后，上皮细胞变性肿胀，呈坏死改变，管腔内见粉染的蛋白管型形成。

2.3 荧光免疫观察结果

对照组术后各时间点，均见肾小球内足细胞被绿色荧光标记，未见细胞同时被两种抗体标记。实验组，在梗阻6h和12h肾小球内足细胞被绿色荧光标记，未见有细胞同时被两种抗体标记；在梗阻后24h，有少量细胞同时被两种抗体标记（图3）；梗阻后3～7d，同时被两种抗体标记的细胞逐渐增多（图4）。但2d后足细胞特异性标记物细胞逐渐减少，巨噬细胞特异性标记细胞逐渐增多。

表1实验组大鼠每高倍视野下同时被红色荧光和绿色荧光标记的平均细胞数Ta b.1Th eme a nn u mb e r o f c e l l sl a b e l e db yb o t hr e da n dg r e e n f l u o r e s c e n c e Group 2W 2month 6h 0.0 0.012h 0.0 0.024h 1.7 1.33d 12.8 12.05d 17.3 16.47d 19.6 19.1

3 讨论

在临床上，随着超声的广泛应用，使胎儿及新生儿肾积水的诊断率大大提高，但是目前对于肾积水手术时机的选择，仍存在争议。此外，梗阻性肾病是婴儿和儿童肾脏衰竭最常见的原因，但是目前对儿童梗阻性肾病的治疗尚局限于手术解除梗阻，而一些学者对后尿道瓣膜患儿远期疗效的观察提示，许多患儿解除梗阻后远期仍存在高血压、肾功能衰竭等严重问题［1］。

我们对肾盂输尿管梗阻儿童肾脏临床和病理研究发现，即使轻度肾积水也有肾脏纤维化的发生，并且术后远期随访观察发现，仍然有一些患儿肾脏功能和形态不能恢复［2］。

因此，对于这些新生儿肾积水以及梗阻性肾病，目前均需寻找肾脏发生不可逆损伤的时相，在肾脏发生不可逆损伤前通过手术解除梗阻，或者应用干预措施减轻肾脏损害。

在肾脏中，足细胞受损伤后不能有效的增殖和修复，从而导致足细胞数量的进行性下降。这种“足细胞减少现象”在慢性肾脏疾病肾小球硬化中起重要作用，而肾小球硬化正是慢性肾衰竭的病理变化基础［3］。局灶节段性肾小球硬化的研究表明：足细胞表型的改变及缺失是肾脏发生不可逆损伤的标志，足细胞在肾脏发育完成后即不能再生，足细胞从肾小球细胞基底膜脱落使基底膜裸露，并且获得巨噬细胞的表型，启动肾脏不可逆性损伤。

在本实验中，我们通过观察输尿管梗阻后肾脏病理改变，以及足细胞表型转化的时序，来确定输尿管梗阻后肾脏发生不可逆损伤的时相，旨在为临床肾积水选择适宜的手术时机提供依据。2周龄和2月龄大鼠肾发育程度分别对应人类新生儿和儿童肾发育程度。因此，我们通过对这两个年龄组大鼠建立单侧输尿管梗阻模型，模拟人类新生儿期和儿童期梗阻性肾病的病理发生发展过程。在本实验中，大体观察梗阻24h后出现肾盂扩张，3d后出现肾皮质变薄。组织学观察，梗阻12h后出现一部分近曲小管扩张，小管上皮细胞呈水样变性肿胀，梗阻3d后出现大量小管上皮细胞变形肿胀、管腔狭窄。我们采用免疫荧光双标的方法，在梗阻后24h，最先观察到有少量细胞同时被两种颜色的荧光标记，表明在这个时间点开始有足细胞向巨噬细胞发生转化。提示肾脏的不可逆损害发生在梗阻的早期。并且2周大鼠和2月龄大鼠发生足细胞表型改变的时间点是一致的，但是在同一梗阻时间点2周大鼠比2月大鼠发生转化的足细胞多，提示与成年大鼠相比，年幼大鼠足细胞对输尿管梗阻的耐受力差。随着输尿管梗阻时间的延长，同时被两种荧光标记的细胞逐渐增多，从梗阻1d到7d呈上升趋势，表达巨噬细胞特异性标记物的细胞也逐渐增多，而足细胞特异性标记物逐渐减少，说明足细胞的损害发生在梗阻早期，随梗阻时间的延长，足细胞转化逐渐增多，并且足细胞发生转化的时间大致与肾盂明显扩张的时间相同。对于输尿管梗阻的动物模型研究表明，输尿管梗阻后肾脏病理改变（包括肾小管萎缩和间质纤维化）要早于肾脏形态学的改变（肾盂扩张）［4，5］。我们通过实验证实了这一观点，小管上皮细胞首先出现变性坏死，其次为足细胞发生表型转化，最后才出现了肾盂扩张等形态学表现。

［1］KarmarkarSJ.Long-termresultsofsurgeryforposteriorurethralvalves：a review［J］.Pediatr Surg Int，2001，17（1）：8-10.

［2］Yang Yi，Ji Shijun，Zhao Guogui.Evaluation of renal function in children with moderate or severe hydronephrosis after operation［J］.Chinese Medical Journal，2002，115（1）：123-125.

［3］Durvasula RV，Shankland SJ.Podocyte injury and targeting therapy：an update［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens.，2006；15（1）：1-7.

［4］Thornhill BA，Burt LE，Chen C，et al.Variable chronic partial ureteral obstruction in the neonatal rat：a new model of ureteropelvic junction obstruction［J］.Kidney Int，2005，67（1）：42-52.

［5］Seseke F，Thelen P，Heuser M，et al.Impaired nephrogenesis in rats with congenital obstructive uropathy ［J］.JUrol，2001，165（6）：2289-2292.

（编辑 孙宪民，英文编辑 郑华川）

Renal Pathological Appearance and Podocyte Phenotype after the Ureteral Obstruction

YUXue-xin1，WANGChang-lin2，SUNRong-guo2，YANGYi2
（Department of Pediatrics；2.Department of Pediatric Surgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo find time point of the irreversible kidney injury by observing renal pathological appearance and podocytes phenotype after complete ureteral obstruction.MethodsThe animal model of complete unilateral ureteral obstruction was constructed in 2-weekold and 2-month-old rats respectively.HEstaining was employed to evaluate the degree of pathological changes，and immunofluorescence double staining to observe the transitional progression of podocyte.ResultsGrossly，there appeared pyelectasis at 2h after obstruction and thinner renal cortex after 3days of obstruction.Histologically，proximal tube display dilated and hydropic degeneration of tubular epithelial cells was observed after 12-day obstruction.The tubular epithelium showed distorted swelling after 3-day obstruction.Immunofluorescence double staining showed that podocytes decreased and the double-labeled macrophages was increased during 1d to 2d after unilateral ureteral obstruction operation.ConclusionCompared with control groups，the unilateral ureteral obstruction groups shows podocyte-to-macrophage transition at 1d after the operation，while the pelvis shows obviously dilated.From the 1st day to the 7th day after unilateral ureteral obstruction，it shows increasing tendency of the podocytes transition.

unilateral ureteral obstruction；podocyte cell transition；renal injury

R692.2

A

0258-4646（2010）01-0001-03

国家自然科学基金资助项目（30672192）

于雪馨（1981-），女，助教，硕士.

杨屹，E-mail：yangy2@sj-hospital.org

2009-09-22