兔脑创伤后早期血清β淀粉样前体蛋白动态变化的实验研究

黄海能，罗起胜，赵邦，谭源福，邓元央，黄华东，符黄德，李传玉

（1.广西右江民族医学院 附属医院神经外科，广西 百色 533000；2.广西医科大学 附属第一医院神经外科，南宁 530021）

兔脑创伤后早期血清β淀粉样前体蛋白动态变化的实验研究

黄海能1，罗起胜1，赵邦1，谭源福2，邓元央1，黄华东1，符黄德1，李传玉1

（1.广西右江民族医学院 附属医院神经外科，广西 百色 533000；2.广西医科大学 附属第一医院神经外科，南宁 530021）

目的 探讨兔脑创伤后血清β淀粉样前体蛋白（β-APP）含量与损伤程度及其时间动态变化相关性。方法 将24只大白兔随机分为对照组和轻、中、重度脑损伤组，各组于不同时间点（0.5h、2h、6h、24h）采集标本，检测血清β-APP的含量。结果采用完全随机设计多因素重复测量方差分析和组间两两比较的LSD检验进行统计学分析。结果 脑损伤后血清β-APP均升高。中、重度损伤组各时间点血清β-APP含量较对照组和轻度损伤组升高（P＜0.05），重度损伤组血清β-APP含量各时间点均高于同时间点的中度损伤组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；轻度损伤组血清β-APP含量与对照组相比在统计学上无显著性差异（P>0.05）。结论 脑损伤后血清β-APP含量升高，且损伤越重血清β-APP含量越高。血清β-APP含量可作为早期判断颅脑损伤程度指标之一。

创伤性脑损伤；酶联免疫吸附实验法；β淀粉样前体蛋白

近年来，对创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）神经生化标志物的研究已引起许多研究者的注意，其中β淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，β-APP）是新近受到较多关注的脑损害特异性血清标记物，研究β-APP在不同损伤程度TBI后的变化，对继续深入研究TBI后病理生理变化及预测损伤后神经细胞的恢复情况具有重要意义。本研究以新西兰大白兔为实验对象，检测不同脑损伤程度兔血清β-APP含量的变化，初步探讨兔脑创伤后血清β-APP含量与损伤程度的相关性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

健康新西兰大白兔24只，体质量1.8～2.2㎏，3～4月龄，雌雄不限，由广西医科大学医学实验动物中心提供。β-APP检测试剂盒（美国ADL公司生产）；多导生理监护仪MP100（美国CSI公司生产）。

1.2 方法

实验参照霍永强等［1］建立的自由落体兔脑损伤模型。将大白兔随机分为对照组（6只，暴露脑组织，但不进行自由落体撞击）及轻、中、重度损伤组（每组6只，各组均承受不同力量的落体撞击），共4组。麻醉死亡动物不纳入统计。各损伤组分别于伤后0.5h、2h、6h、24h 4个时间点抽取外周静脉血2ml。对照组于针刺后肢疼痛反射恢复后0.5h、2h、6h、24h 4个时间点抽取血标本，4℃、3000r/min离心15min，分离血清-70℃下保存待测。血清β-APP浓度测定均严格按照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对照组、轻、中及重度损伤组组间比较

中、重度损伤组β-APP含量明显高于轻度损伤组及对照组，具有显著性差异（P＜0.05）；重度损伤组β-APP含量各时间点均高于同时间点的中度损伤组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；轻度损伤组各时间点β-APP含量与同时间点的对照组无显著性差异（P＞0.05）。见表1。

2.2 时间点比较

伤后0.5h组、2h组与6h和24h组β-APP含量比较有显著性差异（P＜0.05），且6h组和24h组比较差异亦有显著性（P＜0.05），其余均无统计学意义。见表1。

2.3 各组组内各时间点比较

中度组0.5h和2h与24h β-APP含量比较差异有显著性（P＜0.05），而重度组只有0.5h和24h比较有显著性差异（P＜0.05），其余均无统计学意义。见表1。

表1大白兔不同脑损伤程度β-APP含量随时间的变化（±s，p g/mg）Ta b.1Th e r e l a t i o n s h i p o f s e r u mβ-APPl e v e l s w i t h d e g r e e o f t r a u ma t i c b r a i n i n j u r y a n d t h e v a r i a n c e o f t i me（±s，p g/mg）Group 0.5h 2h 6h 24h Normal control 310.52±128.74 370.69±63.17 363.08±127.35 402.55±23.34Slight injury 429.95±42.77 332.60±58.15 387.15±36.65 432.22±153.6Moderate injury 451.62±54.09 514.06±130.57 616.91±194.27 729.91±128.25Serere injury 498.69±34.35 609.90±257.58 700.07±173.62 780.41±161.48

3 讨论

β-APP是一种具有受体样结构的大分子跨膜糖蛋白，由高尔基体产生并由轴突的快速轴浆运输通道运输，正常情况下广泛表达于大多数细胞，以神经细胞和星形胶质细胞中含量较丰富。β-APP先后经β-分泌酶（beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme，BACE1）和γ-分泌酶剪切生成β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）多肽，BACE1是脑内 Aβ形成的关键酶。病理条件下，脑内的BACE1蛋白含量及其酶活性升高，细胞内Aβ的生成量增加从而对细胞产生毒性作用。研究发现［2］，在肿胀的轴突中可见β-APP阳性反应，且头部损伤后β-APP阳性的轴索部位表现为弥漫性轴索损伤中所描述的轴突回缩球，提示轴索β-APP的免疫反应性可能代表了轴突损伤。外伤性脑损伤导致的细胞骨架崩解，细胞轴浆流动停止是β-APP在轴突积聚的一个重要原因［3］，所以多数学者认为 APP是轴突损伤和断裂的标志物。可以推测β-APP含量变化与脑创伤程度存在着密切的相关性。

本研究发现，脑损伤组0.5h内血清β-APP含量就出现增高，并呈上升趋势；中、重度脑损伤组升高幅度显著增大，其血清β-APP含量明显高于轻度脑损伤组及对照组。提示，脑创伤后可引起血清β-APP含量增高，创伤越重，血清β-APP含量越高，且与损伤程度呈正相关。此结果表明，脑创伤后导致神经细胞、星形胶质细胞损害，轴索扭曲、肿胀、断裂，细胞骨架崩解，轴浆外溢，血-脑屏障破坏或功能障碍，血-脑屏障的通透性增加，β-APP进入血液循环［4］。脑创伤越重，对神经细胞、神经纤维、星形胶质细胞的破坏越明显，影响范围更广泛，同时，脑损伤后损伤部位的缺血及炎症和免疫反应可导致血-脑屏障进一步破坏，使其毛细血管内皮间隙增宽，血管壁连接松散，血-脑屏障的通透性增加；β-APP可以通过血-脑屏障大量释放到血液循环中［5］。

本实验检测结果发现，重度损伤组β-APP含量各时间点均高于同时间的中度损伤组，但差异无显著性（P＞0.05），这种改变的原因尚不清楚，考虑主要是由于所采用外伤模型以及损伤程度不同造成的，但大致的变化趋势还是一致的。轻度损伤组各时间点β-APP含量与同时间的对照组相比无显著性差异（P＞0.05），提示损伤程度较轻，范围较小，脑组织及血-脑屏障破坏或功能障碍不明显，同时也可能与机体本身作用影响有关。

本实验中，兔脑损伤后0.5h组、2h组与6h组和24h组比较差异有显著性（P＜0.05），6h组和24h组比较也有显著性差异（P＜0.05）；各组组内各时间点血清β-APP含量比较显示，中度损伤组0.5h、2h与24h比较差异有显著性（P＜0.05），而重度损伤组0.5h和24h比较有显著性差异（P＜0.05）。此结果提示，兔脑损伤后随着时间的延长，β-APP含量不断增多，6h时逐渐明显，24h时最明显。有研究发现，早在伤后0.5h，β-APP蛋白表达就开始增加，之后持续增强，于伤后26h强度减弱，增高的时间与本实验结果基本一致。其原因可能是β-APP含量的变化还受到损伤后多种因素的继发影响，β-APP的表达可因细胞应激和缺氧等损害而增强，β-APP过度表达刺激Aβ生成途径，造成Aβ的积聚，后者除对细胞具有直接毒性外，还可增强或放大低糖、兴奋性毒性、自由基等细胞损伤效应［6］，而β-APP对神经系统损伤有高度敏感性，神经元的损伤会导致β-APP免疫反应活性的增加，各因素的共同作用导致形成恶性循环，这些因素的继发影响在6h时逐渐明显，24h时尤为严重。

总之，本研究表明脑创伤后可引起血清β-APP含量增高，并与损伤程度呈正相关，创伤越重，含量越高，随着时间的延长，β-APP含量不断增高。早期检测血清β-APP含量对于脑损伤程度的评判是有一定价值，可以作为诊断评判脑损伤程度的参考指标之一。

［1］霍永强，谭源福.一种改进的落体脑创伤模型［J］.广西医科大学学报，2007，24（2）：217-219.

［2］Hayashi T，Ago K，Ago M，et al.Two patterns of beta-amyloid precursor protein（APP）immunoreactivity in cases of blunt head injury［J］.Leg Med（Tokyo）.2009，11（Suppl 1）：S171-S173.

［3］Leclercq PD，Stephenson MS，Murray LS，et al.Simple morphometry of Axonal swellings cannot be used in isolation for dating lesions after traumatic brain injury ［J］.JNeurotrauma，2002，19（10）：1183-1192.

［4］Hortobágyi T，Wise S，Hunt N，et al.Traumatic axonal damage in the brain can be detected using beta-APPimmunohistochemistry within 35min after head injury to human adults［J］.Neuropathol Appl Neurobiol.2007，33（2）：226-237.

［5］Itoh T，Satou T，Nishida S，et al.Expression of amyloid precursor protein after rat traumatic brain injury ［J］.Neurol Res.2009，31（1）：103-109.

［6］Campard PK，Tasiaux B，Octave JN.The processing and biological function of the human amyloid precursor protein（APP）：lessons from different cellular models［J］.Exp Gerontol，2000，35（6-7）：843-850.

（编辑 裘孝琦，英文编辑 郑华川）

The Dynamical Changes of Serum β-APPin Early Stage of Rabbit Traumatic Brain Injury

HUANGHai-neng1，LUOQi-sheng1，ZHAOBang1，TANYuan-fu2，DENGYuan-yang1，HUANGHua-dong1，FUHuang-de1，LIChuan-yu1

（1.Department of Neurosurgery，The Affiliated Hospital，Guangxi Youjiang Medical College，Baise 533000，China；2.Department of Neurosurgery，The Affiliated Hospital，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

ObjectiveTo explore the relationship of serum levels of β-amyloid precursor protein （β-APP）with degree of traumatic brain injury （TBI）and the traumatic time.MethodsSprague-Dawley （SD）rats were randomly divided into normal control and injury group.The rats in injury groups suffered from TBIafter free-falling percussion with different pressure（wild-injury，moderate-injury and severe-injury group）.Then serum was collected at 0.5h，2h，6h，and 24h and subject to β-APPdetection by ELISA.All data were analyzed statistically with completely randomized design multiple factor repeated measure of variance analysis and least significant difference（LSD）test.ResultsThe serum levels of β-APPwere higher after injury.The serum levels of β-APPwere significantly higher in moderate-injury or severe-injury group than those in normal group or slight-injury group（P<0.05）.The serum levels of β-APPwere higher in severe-injury group than that in moderate-injury group with no statistical difference （P>0.05）.There was no statistical difference in serum β-APPlevels between normal control and slight-injury group （P>0.05）.ConclusionThe serum level of β-APPis increasingly higher with traumatic brain injury more serious and could be employed as an indicator of TBIdegree.It implies that β-APPhas the potential as an early diagnosis marker for TBI.

traumatic brain injury；enzyme linked immunosorbent assay；β-amyloid precursor protein

R446.1

A

0258-4646（2010）01-0022-02

广西省自然科学基金资助项目（0663030）

黄海能（1968-），男，副主任医师，副教授.E-mail：hnhuang@126.com

2009-04-12