禽源大肠埃希菌质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的检测*

张维秋,潘渭涓,陈 祥,耿士忠,黄金林,潘志明,焦新安

(扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室,江苏扬州 225009)

禽源大肠埃希菌质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的检测*

张维秋,潘渭涓,陈 祥,耿士忠,黄金林,潘志明,焦新安*

(扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室,江苏扬州 225009)

从我国部分地区病、死家禽中分离到大肠埃希菌403株。按照CLSI(clinical and laboratory standards institute)推荐的K-B药敏纸片法对其中的344株分离株进行药敏纸片试验;根据GenBank上发表的序列,设计并合成了五对引物,对所有分离细菌进行质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的扩增:qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-ib-cr和qepA。1993年-1996年禽源大肠埃希菌分离株仅对萘啶酸的耐药率超过60%;2001年-2008年禽源大肠埃希菌分离株对1-3代7种喹诺酮类药物的耐药率均超过58%。在403株禽源大肠埃希菌中共检出3(0.7%)株qnrB阳性菌株,2(0.5%)株qnrS阳性菌株,5(1.2%)株aac(6′)-ib-cr阳性菌株以及5(1.2%)株qepA阳性菌株,未检测到qnrA阳性菌株。结果显示,近20年来,我国禽源大肠埃希菌对喹诺酮类药物的耐药性不断上升,同时,质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因在禽源大肠埃希菌中呈不断上升的流行趋势。

禽;大肠埃希菌;喹诺酮耐药性;质粒介导

长期以来,以治疗、预防疾病和促进畜禽生长为目的,不合理使用抗生素,导致抗生素过度使用或滥用,在抗生素的选择性压力下,大肠埃希菌耐药性不断上升,这已成为严重的公共卫生问题[1]。喹诺酮类药物在临床上是我国治疗禽大肠埃希菌病的常规用药之一,而对喹诺酮类药物的不合理使用导致了细菌耐药性的增加以及耐药谱的变化,细菌对喹诺酮类药物的耐药机制过去普遍认为主要为染色体基因突变,而不存在水平传播的可转移基因。近年来开始出现一些新的喹诺酮类药物耐药基因位于细菌质粒上,使得喹诺酮类药物耐药性在人兽共患病原菌间的迅速扩散成为可能,严重威胁人类健康。

1998年,Martinez-M artinez L等[2]发现了第一个质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因 qnr(现命名为qnrA),其编码蛋白与Ⅱ型拓扑异构酶特异性结合,导致细菌耐药。近年来,qnrB[3],qnrS[4],aac(6′)-Ib-cr[5],qepA[6]等新型质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因陆续被报道证实。质粒介导的喹诺酮类药物耐药机制补充了传统的细菌对喹诺酮类药物的耐药途径,使得耐药的形式多样化。

本研究通过药敏纸片法分析我国禽源大肠埃希菌对喹诺酮类药物的耐药性变化,同时通过PCR检测质粒介导的喹诺酮类药物耐药(PMQR)基因,了解PMQR在禽源大肠埃希菌中的流行情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源和培养条件 1993年-2009年从江苏、上海等18个省、市、自治区收集具有大肠埃希菌病变的禽肝脏、脾脏、卵巢等作病料。大肠埃希菌病料直接划线接种于麦康凯平板,37℃培养18 h,挑取典型菌落在麦康凯平板上分区划线,37℃培养18 h后挑取单个典型菌落纯培养后冻干保存,共分离并保存403株禽源大肠埃希菌。qnrA,qnrB,qnrS阳性菌株由浙江大学医学院蒋琰博士惠赠;qepA阳性质粒由日本国家传染病控制中心Yamane K教授惠赠;aac(6′)-ib-cr阳性菌株由本实验室分离保存。质控菌:大肠埃希菌ATCC25922,金黄色葡萄球菌ATCC25923由本室保存。

1.1.2 主要试剂 8种抗生素药敏纸片:萘啶酸(Nalicixic acid,NA),依诺沙星(Enoxacin,ENX),诺氟沙星(Norfloxacin,NOR),氧氟沙星(Ofloxacin,OFL),氟诺沙星(Fleroxacin,FLX),环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP),洛美沙星(Lomefloxacin,LM L),加替沙星(Gatifloxacin,GAT),均购自杭州微生物试剂有限公司;麦康凯干粉培养基、水解酪蛋白琼脂(MH)等试剂为杭州微生物试剂有限公司产品;DNA marker,DNA polym erase,FokⅠ购自宝生物工程(大连)有限公司;dNTP购自Promega公司;其他常规试剂均为国产分析纯级产品。

1.2 药敏纸片试验

按CLSI推荐的Kirby-Bauer法进行[7],对1993年-2008年分离的344株大肠埃希菌进行药敏试验,参照CLSI手册中药物敏感性标准作出结果判断。

1.3 质粒介导的喹诺酮类药物耐药(PMQR)基因的检测

1.3.1 PMQR基因引物设计 根据文献及Gen-Bank中已发表的序列,分别设计出针对 qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-ib 和 qepA 的 5对特异性引物(引物序列见表1),对403株大肠埃希菌分离株进行检测。

表1 PCR引物序列Tab le 1 The sequences of prim ers for PCR

1.3.2 PCR扩增 细菌DNA模板的制备按全菌裂解法进行[10],qnr的PCR反应参数为94℃预变性3m in,94℃变性30 S,57℃退火30 S,72℃延伸40 S,共进行30个循环;最后72℃延伸7 min,4℃保存,aac(6′)-ib和qepA的退火温度为60℃。对于aac(6′)-ib基因阳性的菌株,PCR产物回收后通过FokⅠ酶切鉴定,变异体不存在此酶切位点,而野生型能被酶切。所有阳性菌株PCR产物送上海英骏生物技术有限公司测序。

2 结果

2.1 禽源大肠埃希菌药敏纸片试验结果

在8种喹诺酮类药物中,大肠埃希菌对第一代喹诺酮类药物萘啶酸的耐药率最高(76.5%),对第四代喹诺酮类药物耐药率最低(19.8%)。耐药率低于50%的有诺氟沙星(40.4%)、氧氟沙星(38.7%)、环丙沙星(44.8%)(表 2)。1993 年-1996年大肠埃希菌分离株耐药率超过60%的仅有萘啶酸(61.6%),对其余7种药物耐药率均低于50%,其中有三种药物的耐药率低于20%,分别为诺氟沙星(19.2%)、氧氟沙星(18.1%)、加替沙星(10.7%)。1997年-2000年大肠埃希菌分离株对氟诺沙星(63.3%)和洛美沙星(60.0%)2种抗生素的耐药率超过60%;2001年-2004年大肠埃希菌分离株对除加替沙星外的7种抗生素耐药均超过66.7%,对萘啶酸的耐药率达到97.7%。2005年-2008年间的大肠埃希菌虽然对前三代喹诺酮的耐药率相较2001年-2004年稍有下降,但是仍然保持一个很高的耐药率(表2)。

表2 禽源大肠埃希菌药敏纸片试验结果Table 2 The result of antimicrobial sensitivity test of avian E.coli isolatesby usingthe Kirby-Bauer method

2.2 质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的检测结果

在403株禽源大肠埃希菌中共检测到qnrB阳性菌株3株,qnrS阳性菌株2株,aac(6′)-ib-cr阳性菌株5株,qepA阳性菌株5株,分别占菌株总数的0.7%,0.5%,1.5%,1.5%。阳性对照株扩增产物电泳结果见图1,PMQR基因阳性菌株背景材料见表3。

图1 阳性对照株PCR产物电泳图Fig.1 Agarose gelelectrophoresis of PCR products of positive strains

表3 质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因阳性菌株的背景资料Table 3 Characteristics of plasm id-mediated quinolone resistance strains

2.3 DNA测序结果

根据National Center for Biotechnology In formation(NCBI)中的BLASTn检索结果显示,阳性菌株所携带的喹诺酮类质粒耐药基因序列与网上公布的序列一致。

3 讨论

近年来,随着喹诺酮类药物的大量使用甚至滥用,大肠埃希菌对喹诺酮类药物耐药率不断上升。本研究结果显示,从上世纪90年代起禽源大肠埃希菌对喹诺酮类部分抗生素耐药性已经较强,近十几年来大肠埃希菌分离株对大部分氟喹诺酮类抗生素耐药性提高了两倍以上。值得注意的是2005年-2008年分离株相较2001年-2004年虽然对1到3代喹诺酮类药物的耐药性稍有下降,但仍然维持了一个很高的水平,这种变化可能在一定程度上归因于新药的推广以及近几年对这些一到三代喹诺酮类药物使用的逐渐减少,但是由于药物之间的交叉耐药性以及新出现的质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因在细菌之间的水平传播,细菌的耐药率仍然维持在很高的水平上;而大肠埃希菌分离株对加替沙星这种2002年在中国新上市的第四代氟喹诺酮类药物的耐药率则一直呈现明显的上升趋势,由之前的10.7%上升到36.0%。

近年来,对细菌喹诺酮类药物的耐药机理研究有了新的发现,过去认为喹诺酮类药物的耐药性是由细菌染色体变异引起的,但新近研究表明质粒介导的喹诺酮类药物耐药性也是其耐药机制的重要组成部分。

质粒介导的喹诺酮耐药(PMQR)于1987年孟加拉国一场Ⅰ型痢疾志贺氏菌爆发中首次发现[12],与PMQR相关的基因命名为qnr[13]。本研究对1993年至2009年间分离的403株大肠埃希菌进行检测,共检测到3株qnrB阳性菌株,2株qnrS阳性菌株;aac(6′)-ib-cr是氨基糖苷乙酰转移酶的变异基因,其本质上是一种氨基糖甙类乙酰转移酶基因aac(6′)-ib的变异体,故只能乙酰化含游离氨基的喹诺酮类,本研究中通过PCR和酶切鉴定共检测到5(1.2%)株aac(6′)-ib-cr基因阳性菌株,其中 4株细菌分离于2008年,1株分离于2009年;耐药基因qepA通过调控外排泵相关基因从而引起细菌对喹诺酮类药物耐药水平的变化,本研究中共检测到qepA阳性细菌5株,阳性率为1.2%,这其中4株阳性菌株来自同一大型养殖场,除1株对加替沙星中敏外,5株细菌对八种喹诺酮类药物都表现出高度耐药。

值得注意的是,2008年共检测大肠埃希菌46株,其中1株细菌为qn rB阳性,4株aac(6′)-ib-cr阳性,PMQR基因的检出率为10.9%;而在2009年,共检测细菌31株,其中2株为qnrB、2株qnrS和1株aac(6′)-ib-cr阳性细菌,PMQR基因的检出率为16.1%。近几年来,PMQR基因在禽源大肠埃希菌中有不断上升的流行趋势。

以上结果显示,近20年来,我国禽源大肠埃希菌对喹诺酮类药物的耐药性不断增强,已成为严重的公共卫生问题。虽然qnr、qepA和 aac(6′)-ib-cr仅介导低水平的喹诺酮类药物耐药性,但它们的存在有助于选择出高水平的喹诺酮类药物耐药性[14]。一般认为低水平耐药性可使细菌数量达到出现突变所需的浓度,从而出现高度耐药。质粒介导的喹诺酮耐药基因,不仅可垂直传给子代,更重要的是可在不同微生物间进行水平传播,加快喹诺酮类药物耐药性在细菌间的传播。因此非常有必要在我国开展质粒介导喹诺酮类药物耐药性的调查研究和耐药机制研究,监测PMQR基因的流行情况,合理使用抗生素,以期减少喹诺酮类药物耐药菌的产生、人兽共患病原菌间耐药性的传递并为药物的开发和临床合理使用提供理论依据。

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Detection of Plasm id-mediated Quinolone Resistance amongEscherchia colifrom Avian in China

ZHANGWe-iqiu,PAN We-i juan,CHEN Xiang,JIAO Xin-an

(Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis,Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225009,China)

A totalof 403E.colifield isolates were derived from clinically affected chickens in 18 provincesof China between 1993 and 2009.Of which 344E.coliisolates from 1990s were carried out to 8 quinoloneant-i m icrobial sensitivity test by using the K irby-Bauer method recomm ended by CLSI(clinical and laboratory standards institute).A ll of the isolates were detected for the presence of qnrA,qnrB,qnrS,aac(6′)-ib-cr and qepA by PCR and sequencing.E.coliisolates from 1993-1996 had a resistancemore than 60%only to Nalicixic acid(61.6%),w hereas isolates from 2001-2008 had a resistancem ore than 58%to 7 antibiotics.Among the403E.coliisolates from China,qnrB,qnrS,aac(6′)-ib-cr and qepA were detected in 3(0.7%),2(0.5%),5(1.2%),and 5(1.2%)isolates,respectively,no qnrA positive isolatew as detected in this study.The results showed that the resistance ofE.colito quinolone agents had been increasing in the past twenty years and therewas a rising prevalence ofE.coliisolates harboring plasm id-mediated quinolone resistance genes in China.

avian;Escherchia coli;quinolone resistance;p lasm id m ediation

S854.43

A

1007-5038(2010)04-0074-05

2010-03-24

江苏省自然科学基金(BK2008011);江苏省高校自然科学研究项目(09KJB230002);江苏省重点实验室开放课题(K07016)

张维秋(1986-),女,山东临沂人,硕士研究生,主要从事细菌耐药方面的研究。*通讯作者

经验交流