亚胺培南对头孢他啶有诱导作用的铜绿假单胞菌耐药机制研究*1

姜梅杰

(泰山医学院附属泰山医院，山东 泰安 271000)

铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa,Pa)是一种重要的医院感染病原菌，主要感染医院内免疫力低下患者[1]。一旦感染，临床治疗十分困难。近年来，Pa已成为医院感染最常见的病原菌[1]，对亚胺培南耐药Pa分离率也逐年上升，甚至所谓“泛耐药”(pandrugresistance)或“全耐药”临床分离株也不少见。研究表明，携带各种β内酰胺酶编码基因和(或)外膜通道蛋白OprD2基因缺失是导致Pa对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制[3-5]。β-内酰胺类抗菌药物是临床治疗Pa感染的常见药物，但在临床治疗中经常发生Pa治疗失败，经常发现Pa中亚胺培南可诱导头孢他啶耐药。本研究收集本地区2007年1月～2008年1月临床分离的各类标本325株，纸片扩散法检测可诱导头孢他啶耐药的Pa 116株, 其中93株Pa是亚胺培南耐药头孢他啶敏感的Pa，用PCR法检测IMP、VIM、SPM、GIM基因和外膜通道蛋白OprD2基因，CCCP检测外排泵与亚胺培南和头孢他啶敏感性之间的关系。

1 材料和方法

1.1 菌株 325株Pa来自本地区2007年1月～2008年1月临床分离的各类标本，其中痰液246株，血液32株，尿液26株，伤口分泌物14株，腹水7株，所有菌株经ATB细菌鉴定仪鉴定。

1.2 主要试剂及仪器 微生物鉴定仪为法国生物梅里公司生产的ATB微生物鉴定仪；PCR扩增仪为美国PERKIN ELMER公司9600型基因扩增仪；美国ABI公司377型凝胶自动分析仪。基因扩增引物、TaqDNA酶、dNTPs均由大连宝生物工程有限公司提供。MH琼脂和药敏纸片为Oxoid公司产品，CCCP购自美国Sigma公司。

1.3 药敏试验 采用K-B纸片扩散法测定对庆大霉素(GEN)、亚胺培南(IPM)、头孢吡肟(FEP)、头孢他啶(CAZ)、美罗培南(MEM)、氨曲南(ATM)、阿米卡星(AK)、左氧氟沙星(LEV)、头孢哌酮/舒巴坦(SCF)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、哌拉西林(PIP)、奈替米星(NET)、妥布霉素(TOB)、环丙沙星(CIP)等14种抗生素进行药物敏感性检测。按照美国实验室标准化委员会(NCCLS)2006年版的标准判读。铜绿假单胞菌ATCC27853为质控菌株。

1.4 D试验方法[6]国内介绍解释操作[7]。菌液浓度为0.5麦氏单位,使用4 mm厚度的M-H平板, 亚胺培南和头孢他啶两种纸片边缘之间的距离为15 mm,35 ℃孵育24 h判读结果。判断标准：亚胺培南抑菌圈直径≤13 mm为耐药, 头孢他啶抑菌圈直径≥18 mm为敏感。当头孢他啶纸片的抑菌环在靠近亚胺培南纸片一侧出现平截现象,即头孢他啶纸片的抑菌环看似一大写D时,判为D-试验阳性或亚胺培南对头孢他啶具有诱导耐药性。两纸片抑菌环均为圆形,判为D-试验阴性。

1.5 外排泵抑制试验 采用琼脂稀释法测定亚胺培南耐药头孢他啶敏感并且亚胺培南可诱导头孢他啶耐药的Pa加入CCCP前后对亚胺培南和头孢他啶的MIC值。CCCP在琼脂平皿中的终浓度为5 mg/L[8]。

1.6 含亚胺培南前后头孢他啶MIC值分析 采用琼脂稀释法测定93株亚胺培南耐药头孢他啶敏感并且亚胺培南可诱导头孢他啶耐药的Pa对头孢他啶的MIC值。同时制备含有0.5、1、2、4 μg/ml亚胺培南的头孢他啶梯度浓度(0.125～64μg/ml倍比稀释)的M-H琼脂平板,测定细菌MIC[9]。同时增加了含0.5、1、2、4 μg/ml亚胺培南的头孢他啶梯度浓度(3 μg/ml和6 μg/ml)的M-H琼脂平板。

1.7 细菌DNA模板制备 采用煮沸法，吸取250μl双蒸水，挑取过夜培养的菌落2～3个，加入双蒸水中，混均后加热煮沸15 min以15000 r/min的速度在低温高速离心机中离心15 min，将上清液转移到另一个干净的无菌微量试管中，即细菌总DNA溶液，-20 ℃存备用。

1.8 耐药基因检测 各种耐药基因检测均采用PCR法。相关引物的名称、序列和预期扩增片段大小见表1。各种耐药基因扩增的循环参数均为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸60 s，循环35次；最后72℃延伸5 min。所得PCR产物用含EB的1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.9 PCR产物测序 PCR纯化产物送大连宝生物工程有限公司测序。结果用NCBI的BLAST软件对所得基因序列进行比对分析。

表1 4种金属酶相关基因，外膜通道蛋白OprD2基因引物序列

2 结 果

2.1 抗菌药物敏感试验结果 93株Pa对14种抗菌药物的敏感性，见表2。

2.2 亚胺培南耐药率及D-试验发生率 325株Pa中, 51.7%(168/325) Pa对亚胺培南耐药, 35.7%(116/325) 亚胺培南可诱导头孢他啶耐药。116株Pa中80.2% (93/116)是亚胺培南耐药而头孢他啶敏感的菌株, 19.8% (23/116)是亚胺培南和头孢他啶敏感的菌株。

2.3 主动外排机制分析 CCCP存在时亚胺培南和头孢他啶的MIC结果与CCCP不存在时亚胺培南和头孢他啶的MIC结果无明显变化。

2.4 含亚胺培南前后头孢他啶MIC检测结果 93株亚胺培南耐药头孢他啶敏感并且亚胺培南可诱导头孢他啶耐药的Pa中, 在含有0.5、1、2、4 μg/ml亚胺培南的头孢他啶梯度浓度(0.125～64 μg/ml倍比稀释)的M-H琼脂平板, 同时增加了含0.5、1、2、4μg/ml亚胺培南的头孢他啶梯度浓度(3μg/ml和6μg/ml)的M-H琼脂平板。测定细菌MIC值比不含亚胺培南时MIC值升高4～12倍亚胺培南诱导头孢他啶。

2.5 金属酶基因和外膜通道蛋白OprD2基因检测结果 未检出VIM、GES、IMP和SPM基因。87.1% (81/93)外膜通道蛋白OprD2基因缺失。OprD2基因电泳图见图1。

表2 93株Pa对14种抗菌药物的敏感性

图1 OprD2基因PCR电泳图

3 讨 论

铜绿假单胞菌广泛分布于自然界,是医院感染最常见的革兰阴性杆菌之一,在临床的抗感染治疗过程中,容易对临床常用的抗生素产生耐药性,且耐药机制复杂。β内酰胺类和碳青霉烯类抗菌药物曾经是铜绿假单胞菌感染治疗的有效药物，近年来, β内酰胺类抗菌药物包括亚胺培南在内的碳青霉烯类抗菌药物耐药率逐年上升，致使抗感染治疗面临严峻挑战。自上世纪90年代以来，国外学者应用分子生物学技术发现，Pa可以获得TEM、SHV、OXA、PER、CRPE 、DHA、VEB、IMP、VIM、SPM等β内酰胺酶基因，所表达的产物可以水解β-内酰胺类和碳青酶烯类药物，我国以及世界各地均有发现[10-12]。Pa外膜蛋白中OprD2是亚胺培南进入菌体的特异性通道。本研究显示，116株(35.7%)Pa亚胺培南可诱导头孢他啶耐药，其中80.2% (93/116)是亚胺培南耐药头孢他啶敏感, 19.8% (23/116)是亚胺培南和头孢他啶均敏感。93株Pa中，未检出IMP、VIM、SPM和GIM基因，87.1% (81/93)外膜通道蛋白OprD2基因缺失，提示本地区对亚胺培南耐药的主要原因是外膜通道蛋白OprD2基因缺失。本研究结果显示 CCCP存在时亚胺培南和头孢他啶的MIC值与CCCP不存在时亚胺培南和头孢他啶的MIC值无明显变化，提示外排泵CCCP与亚胺培南和头孢他啶敏感性无关。由于本地区对头孢他啶的耐药率低，因此临床医师经常选用头孢他啶治疗由铜绿假单胞菌引起的感染，但在临床实际工作中经常发现Pa和其他细菌混合感染的病例，这就要求临床医师有时必须同时用二种抗菌药物抗感染治疗。两种抗菌药物如有拮抗作用，往往造成可诱导的抗菌药物抗菌活性降低，引起抗感染治疗失败，给临床医师应用抗生素带来了很大的困难。因此，临床微生物室人员应开展D-试验,以指导临床医生更准确的使用抗菌药物。

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