海金沙提取液抑制草酸钙结石的化学基础研究

王润霞,王秀芳,谢安建,沈玉华,周建庆,邾枝花

(1.安徽大学 化学化工学院,安徽 合肥 230039;2.安徽医学高等专科学校,安徽 合肥 230601)

生物体中存在着许多生物矿物，这些生物矿物中包含的无机物是自然界常见的无机矿物，如草酸钙、碳酸钙和磷酸钙等.生物矿化是指在有机基质调控和参与下生物矿物在生物体内的形成过程，尿结石是生物体内病理矿化的产物，其中70%～80%的晶体成分为草酸钙(CaOxa)，它有三种水合物形式：即热力学稳定的一水草酸钙(CaOxa(H2O，COM)、亚稳态的二水草酸钙(CaOxa(2H2O，COD)和热力学不稳定的三水草酸钙(CaOxa(3H2O，COT).由于COM是热力学稳定状态，因此是结石中最普遍的晶型，约占70%以上[1].由于COD表面呈电中性，其与细胞膜表面的粘附能力大约是COM的二分之一，与肾小管细胞的接触程度较小，与肾小管细胞表面结合力较弱，比COM更容易随尿排出体外[2].因此，抑制COM形成或稳定COD在尿液中的存在，有利于治疗草酸钙结石.

中草药治疗尿结石具有副作用小、价格便宜和疗效明显等优点，已成为治疗尿结石的重要医疗手段，但其治疗机制至今尚不清楚.本课题组曾研究了金钱草[3]、乌梅[4]、玉米须[5]等植物对草酸钙晶体生长的抑制作用，探索了抑制因素的作用原理，为临床寻求防治尿结石的新药提供了一定的理论支持.目前治疗尿结石的中草药使用较多的是“三金”(金钱草、鸡内金、海金沙)、“二子”(冬葵子、车前子)、“二石”(石韦、滑石)等组成的合剂[6]，其中海金沙草系海金沙科Lygodiaceae海金沙属Lygodium多年生蕨类植物海金沙的地上部分.本文采用体外模拟方法研究了单味中药海金沙提取液对草酸钙结晶的影响，从化学配位和草酸钙晶相等角度讨论了其抑制草酸钙结石的化学基础，这将为临床使用海金沙作为治疗尿结石的有效药物提供理论依据和支持.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

草酸钠(北京化工厂)，无水氯化钙(上海泗联化工厂)均为分析纯，水为二次水.海金沙为广西所产，来源于多年生蕨类植物海金沙的地上部分的干燥全草.

傅立叶变换红外光谱在NEXUS-870 型红外光谱仪(美国Nicolet 公司)上测试；扫描电子显微镜(SEM)为S4800 型(日本)，加速电压10KV；物相测试用MAP18XAHF 型X-射线衍射仪完成，测试电压40KV，电流100mA，扫描速度4o/min.DDS-11A电导率仪(上海理达仪器厂).TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂).

1.2 实验方法

1.2.1 海金沙提取液的制备

取海金沙400 g，加二次蒸馏水4000 ml，煮沸60 min，过滤，收集滤液，滤渣加二次蒸馏水4000 ml，煮沸40 min，过滤，合并两次滤液，浓缩成含生药0.05 g·ml-1， 0.2 g·ml-1， 0.4 g·ml-1，0.8 g·ml-1的海金沙提取液，用高速离心机进行离心(转速为11000转/分)，取上清液备用.

1.2.2 海金沙对草酸钙晶体生长的影响

在一只洁净的烧杯中分别加入5 mmol·L-1的CaCl2溶液50 ml，二次蒸馏水50 ml和5 mmol·L-1的Na2C2O4溶液50 ml，搅拌均匀，反应10 min，静置陈化2 h，离心分离，所得样品干燥后待测.分别替换二次水为含生药0.05g·ml-1，0.2g·ml-1，0.4g·ml-1，0.8g·ml-1的海金沙提取液，同法操作，所得样品干燥后待测.

1.2.3 草酸钙结晶动力学研究

结晶动力学通过测定溶液电导率变化来监测.向25ml浓度为5mmol·L-1的CaCl2溶液中加入25ml二次蒸馏水，再加25ml浓度为5mmol·L-1的Na2C2O4溶液，测定所得溶液的电导率，测定过程中用恒定速度搅拌被测溶液.然后分别用生药浓度为0.05g·ml-1和0.4g·ml-1的海金沙提取液替换二次蒸馏水，同法测定电导率.

2 结果与讨论

2.1 海金沙对草酸钙晶体形成的影响

2.1.1 草酸钙晶体的SEM照片

图1 加入不同浓度海金沙提取液后草酸钙晶体的SEM图像(a)0g·ml-1，(b)0.05g·ml-1，(c)0.2g·ml-1，(d)0.4g·ml-1，(e)0.8g·ml-1of lygodium extract，respectively

不同条件下制得的草酸钙晶体的形貌通过扫描电镜观察.图1a为未加海金沙提取液的水溶液中形成的草酸钙晶体照片，照片显示草酸钙晶体为不规则的六边形片状结构，并且聚集成菊花状，这种六边形片状结构的草酸钙是COM型晶体[7]，因此可以推测在未加海金沙提取液形成的草酸钙晶体是COM型.图1b为加入0.05 g·ml-1提取液后形成的草酸钙晶体照片，照片显示有两种形貌的草酸钙晶体，一种是与图1a中晶体相似的大小不一的不规则的六边形片状结构的COM型晶体，另一种是四方锥形晶体，此为COD晶体[8]，晶体的边长约4.5μm，棱长约2.5μm，因此可以推测，加入0.05 g·ml-1海金沙提取液后形成的是COM与COD混合的草酸钙晶体.图1c为加入0.2 g·ml-1海金沙提取液后形成的草酸钙晶体照片，与图1b相似，也有两种形貌的晶体，一种是大小不一的六边形片状的COM晶体，另一种是大小不一的四方锥形的COD晶体，晶体的平均边长约3μm，平均棱长约1.5μm，因此可以推测，加入0.2 g·ml-1海金沙提取液后形成的也是COM与COD混合的的草酸钙晶体，所得COD晶体比图1b中的小.图1d为加入0.4 g·ml-1提取液后形成的草酸钙晶体的SEM图像，照片中没有发现片状六边形COM晶体，只有大小均匀的四方锥形的COD型晶体.图1e为加入0.8 g·ml-1提取液后形成的草酸钙晶体的SEM图像，图中也没有发现片状六边形晶体，与图1d比较，晶体由四角双锥形变为四角双锥柱形，两端的锥形面更趋于圆钝，柱体长约为0.5μm，晶体明显要比1d中晶体的尺寸小，初步推测，此条件下所得草酸钙也只是COD型的晶体.从上述讨论可以推测海金沙提取液不仅可以抑制COD晶体向COM晶体转化，而且随海金沙提取液浓度增大COD晶体尺寸随之减小.

2.1.2 草酸钙晶体的FTIR光谱

图2 加入不同浓度海金沙提取液后草酸钙晶体的FTIR谱图(a) 0 g·ml-1，(b) 0.05 g·ml-1，(c) 0.4 g·ml-1，(d) 0.8 g·ml-1of lygodium extract，respectively

图2所示为加入不同浓度海金沙提取液后生长的草酸钙晶体的FTIR谱图.在不加海金沙提取液生长的草酸钙晶体的FTI R光谱如图 2a所示，COO-的伸缩振动带ν(COO-)为1318 cm-1，反对称伸缩振动带νas(COO-)以双峰出现，双峰位置分别在1618cm-1和1650 cm-1，峰位置与文献[9]报道的COM和COD晶体吸收峰吻合，在指纹区内，为COM的特征峰657 cm-1，这表明，此时生成的草酸钙晶体主要为COM[10].在0.05g·ml-1海金沙提取液中生长的草酸钙晶体的FTIR光谱如图 2b所示，COO-的伸缩振动带ν(COO-)为1326 cm-1，νas(COO-)也以双峰出现，双峰位置分别在1618cm-1和1650 cm-1，在指纹区内，又出现双峰，分别为COM的特征峰657 cm-1和COD的特征峰618cm-1，表明形成的晶体为COM和COD的混合物[9].在0.4 g·ml-1海金沙提取液中生长的草酸钙晶体的FTIR光谱如图 2c所示，COO-的伸缩振动带ν(COO-)为1326 cm-1，νas(COO-)也以双峰出现，双峰位置分别在1618cm-1和1650 cm-1，在指纹区COD的特征峰出现在918，616cm-1处，表明此时形成的草酸钙晶体主要为COD型.在0.8 g·ml-1海金沙提取液中生长的草酸钙晶体的FTIR光谱如图 2d所示，COO-的伸缩振动带ν(COO-)为1326 cm-1，νas(COO-)以单峰出现，峰位置分别在1647 cm-1，在指纹区COD的特征峰出现在918，616cm-1处，表明此时形成的草酸钙晶体为COD型，与SEM推测结果一致.

2.1.3 草酸钙晶体的XRD图

图3 加入不同浓度海金沙提取液后草酸钙晶体的XRD图谱(a) 0 g·ml-1，(b) 0.05 g·ml-1，(c) 0.2 g·ml-1，(d) 0.4 g·ml-1，(e) 0.8 g·ml-1of lygodium extract，respectively

图4 加入不同浓度海金沙提取液后草酸钙晶体生长过程中溶液电导率和时间的关系

2.2 加入不同浓度海金沙提取液后草酸钙晶体生长的动力学研究

加入不同浓度海金沙提取液后草酸钙过饱和溶液结晶沉淀过程中溶液电导率随时间的变化如图4所示.从图4a可以看出，在未加海金沙提取液的水中，加入CaCl2溶液再加入Na2C2O4溶液后，所测电导率在短时间内迅速下降，1分钟后电导率基本不变，即达到沉淀溶解平衡，说明Ca2+离子与C2O42-离子反应迅速聚集成核.从图4b可见，加入0.05g·ml-1海金沙提取液后，电导率的动力学曲线下降缓慢，1.5分钟后达到沉淀溶解平衡.当加入0.8 g·ml-1海金沙提取液后(图4c)，电导率的动力学曲线下降更缓慢，2.5分钟后才达到沉淀溶解平衡，表明CaC2O4晶体的成核速率随着海金沙提取液浓度增大变小，这可能是因为随海金沙提取液浓度增大，其中的有效成分与Ca2+络合能力增大，抑制了晶体的成核.以上情况说明海金沙提取液对草酸钙晶体的成长具有抑制作用，并且随着海金沙提取液浓度增大，这种抑制作用增强.

2.3 海金沙提取液对草酸钙结晶的影响机理探讨

图5 海金沙提取液的红外光谱

图5a是海金沙提取液的红外光谱，图中位于1611 cm-1处的吸收峰对应于有机酸或者多糖中vsC=O的伸缩振动.图5 b是海金沙提取液和CaCl2混合液的红外光谱，从图中可看出，海金沙提取液和CaCl2混合液的vsC=O的伸缩振动峰移至1619 cm-1.这可能是由于海金沙提取液中存在蒙花苷、香叶木苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、(6S,9R)-6-羟基-3-酮-α-紫罗兰醇-9-O-β-D-葡萄糖苷、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸、正二十五烷酸和正二十六烷酸等成分[12]，含有羧基、羟基、羰基等基团，这些基团与钙结合形成可溶性配位络合物，因此vsC=O的伸缩振动峰发生红移.同时，蒙花苷、香叶木苷属黄酮类物质，黄酮类物质中的羟基可以与Ca2+配位形成配合物[13],同时提取液中一些相对分子质量较大的单体成分(如黄酮、糖苷等)不但能与Ca2+形成配合物，而且还能以疏水、交叠、包合等方式形成分子络合物，减小Ca2+与Oxa2-的络合能力，从而降低CaOxa的过饱和度，低饱和条件抑制了CaOxa的成核和生长.

在几种晶型的草酸钙晶体中，COM在单位面积里具有最多的吸附点，吸附能力最强，而COD在单位面积里具有最少的吸附点，吸附能力最弱.要使COD在水溶液中保持长时间的稳定性，就需要使用添加剂将COD晶体全部覆盖[14].本论文中当加入海金沙提取液为0.05或0.2 g·ml-1时，其有效成分可能不足以将形成的COD晶面全部覆盖，不能完全阻止COD转变为COM，故存在COM和COD两种晶体.随着海金沙提取液浓度增大，有效成分与COD的吸附位点键合增多.当加入海金沙提取液等于或大于0.4 g·ml-1时，估计其有效成分在COD上的吸附已达到最大值，减小了COD晶体的溶解速率，增强了COD晶体在溶液中的热力学稳定性，进而抑制了COD晶体向COM转变，故此条件下形成的草酸钙晶体主要为COD型.

3 结论

综上所述，海金沙提取液中的有机分子可以抑制亚稳态草酸钙晶体COD向热力学更为稳定的COM转化，并且随着海金沙提取液浓度的增加，这种抑制效果更加明显，同时COD晶体尺寸随海金沙提取液浓度增大而变小.由于抑制COM晶体的形成及减小COD尺寸均有利于阻止草酸钙结石的形成，因此，该结果为临床使用海金沙作为防治尿结石的有效药物提供了理论支持，并且还可为开发新的防治草酸钙结石的中草药提供启示.

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