银杏叶提取物对噪声致大鼠螺旋神经节损伤的保护作用

常傲霜 陈乾美 卓贤露 刘鲜林 孔祥林

噪声对人体的听觉系统会造成不同程度的损伤，暴露于一次短暂强噪声或者长期反复的噪声可导致噪声性听力损失(noise-induced hearing loss)，严重时可造成听觉系统永久性的损害。近年的研究发现[1], 引起噪声性听力损失的原因除了与机械损伤、血运障碍有关外, 还与耳蜗内产生大量的氧自由基密切相关。内耳自由基改变是多种感音神经性聋的主要病理基础之一，研究表明，自由基清除剂能减轻噪声引起的听损伤[2]。银杏叶提取物(the extract of ginkgo biloba,EGb)被认为是一种自由基清除剂，研究显示, 它对于神经系统的氧化损伤有治疗作用[3]，但对于改善耳蜗神经噪声性损伤是否有效尚缺乏研究。本实验旨在探讨银杏叶提取物是否对噪声致大鼠耳蜗螺旋神经节的损伤具有保护作用，期望为治疗噪声性听力损失提供有效的治疗手段。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选用健康SD大鼠36只，鼓膜完整，耳廓反射灵敏，体重200～250 g，雌雄不拘(由贵阳医学院实验动物中心提供), 固定室温、自然光照、自然饮食饮水饲养。随机分为三组：正常对照组(正常组)、生理盐水+噪声暴露组(噪声组)、银杏叶提取物+噪声暴露组(用药组)，每组12只。白噪声由丹麦B&K 2209声级计和2606测量放大器校准作频谱分析，噪声中心频率为4 kHz ，强度为110 dB SPL 。将噪声组和用药组动物置于隔声室的铁笼内，每天持续噪声暴露6小时，共10天，动物活动范围内声强相差最大不超过5 dB。噪声暴露后动物置于安静环境下饲养。用药组大鼠从噪声暴露开始腹腔注射银杏叶提取物10 ml/d(购于德国威玛舒培博士大药厂，17.5 mg,每支5 ml)，噪声组则腹腔注射生理盐水10 ml/d，均连续注射10天，正常组仅腹腔注射生理盐水10 ml/d，连续10天，不作噪声暴露，三组动物在实验前及实验第10天均分别进行ABR测试，第二次ABR测试后处死动物。三组中每组均随机用4只动物双耳做透射电镜观察，8只大鼠双耳做SOD、MDA检测。

1.2听性脑干反应(ABR)测试 于测试前以1%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉动物，测试在隔声室内进行,用电反应测听仪测定双耳ABR阈值。安放皮下银质针形电极，记录电极置颅顶正中部, 参考电极和接地电极分别置于同侧和对侧耳廓。click声刺激，刺激频率20次/秒，耳机给声，扫描时间10 ms，滤波范围100～3 000 Hz,叠加1 024 次，以重复性好、比较稳定的波Ⅲ为基准确定反应阈，观察出现反应的最低强度即为ABR阈值。

1.3透射电镜标本制作 快速断头处死动物，取出双侧听泡暴露耳蜗，蜗顶钻孔，用1%戊二醛和4%甲醛混合液耳蜗灌流1 min，标本浸入4%戊二醛液固定，在体式显微镜下取出耳蜗底回蜗轴，用10% 乙二胺四乙酸溶液脱钙7～10 d ，1%锇酸后固定，脱水、渗透、Epon 812包埋、聚合、组织定向包埋，半薄切片定位，超薄切片50 nm，电子染色。日立H-7650透射电镜(TEM)观察并拍片。

1.4耳蜗SGN的MDA 含量及SOD活性测定 各组8只大鼠断头后取出双侧耳蜗，体式显微镜下分离出蜗轴，制成10%的组织匀浆，高速冷冻离心机离心，取上清液用硫代巴比妥酸显色法测丙二醛(MDA)含量，单位nmol/ml，用亚硝酸盐形成法测定SOD活性，单位U/ml。测试方法严格按照试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书方法进行。

1.5统计学方法 应用SPSS11.0统计软件包进行各组数据间的单因素方差分析，方差分析整体比较有差异后再使用q检验进行组间两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠ABR反应阈 各组动物ABR 反应阈见表1。实验前三组大鼠ABR反应阈差异无统计学意义(P>0.05)。噪声组噪声暴露后ABR反应阈较噪声暴露前及对照组显著提高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明噪声性聋动物造模成功。噪声暴露后，用药组ABR反应阈较噪声组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠ABR反应阈(n=24耳)

注：*与正常组及噪声暴露前比较，P<0.05; △与噪声组比较，P<0.05

2.2各组大鼠耳蜗螺旋神经节细胞SOD活性和MDA含量 噪声组和用药组耳蜗螺旋神经节细胞内的SOD活性与正常组比较降低明显，用药组SOD活性较噪声组增加，差异有统计学意义(P<0.05) 。噪声组与正常组比较，MDA含量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，用药组MDA含量较噪声组显著降低 (P<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠耳蜗螺旋神经节SOD、MDA检测结果(n=16耳)

注：*与正常组比较，P<0.05; △与噪声组比较，P<0.05

2.3透射电镜观察 正常组大鼠耳蜗螺旋神经节细胞结构保存良好，核圆，染色质均匀，线粒体结构保存良好，呈卵圆形，嵴清晰可见，无肿胀溶解，内质网均匀分布(图1)。噪声组螺旋神经节细胞胞内可见核异染色体固缩, 在核膜周边聚集成块或形成新月形，线粒体数量明显减少，线粒体嵴断裂，呈空泡状，粗面内质网脱颗粒(图2)。用药组螺旋神经节细胞核形态基本正常，线粒体数目无明显减少，嵴清晰可见，少部分嵴断裂，可见部分粗面内质网(图3)。

3 讨论

银杏叶提取物具有多种生物活性，它能对抗脑损伤中神经元的死亡， 促进中枢神经系统受损后的修复，对神经细胞有直接抗脂质过氧化、抗神经毒化的保护作用[3]。林浩东等[4]研究银杏酮酯对大鼠坐骨神经损伤后神经再生的影响时, 发现银杏叶提取物可以促进损伤神经的再生。

图1 正常组大鼠耳蜗螺旋神经节细胞 线粒体呈卵圆形，嵴清晰可见，细胞核结构保存良好图2 噪声组大鼠螺旋神经节细胞 细胞核异染色质聚集成块，边集于核膜下，细胞内线粒体数量明显减少，大部分嵴消失，呈空泡状图3 用药组大鼠螺旋神经细胞 细胞肿胀减轻，核形态基本正常，线粒体嵴清晰，少部分断裂

有文献报道，动物噪声暴露后听功能可能有一个逐步恢复的过程，至7天阈值稳定在一个水平，表明噪声暴露后会经历一个暂时性阈移阶段，以后呈永久性阈移[5]。本研究噪声组和用药组动物连续噪声暴露10天后，两组的ABR反应阈均较正常组提高(P<0.05)，但用药组ABR反应阈较噪声组显著降低(P<0.05)，说明噪声对大鼠听功能造成了损伤，但用药组大鼠噪声暴露的同时加用了银杏叶提取物后，损伤明显减轻，说明银杏叶提取物对大鼠的听功能有一定的保护作用。

从文中结果看，正常组大鼠耳蜗螺旋神经节细胞结构保存良好，形态正常，噪声暴露后噪声组螺旋神经节细胞损伤严重，大部分线粒体空泡化，核异染色质边聚于核膜下，而用药组螺旋神经节细胞损伤明显轻于噪声组，说明银杏叶提取物对连续噪声暴露的大鼠耳蜗螺旋神经节细胞有保护作用。

SOD活性能反映细胞内清除自由基即抗氧化的能力。本实验生化检测结果显示噪声组大鼠耳蜗螺旋神经节细胞内的总SOD活性较其他两组明显下降，表明噪声能明显降低耳蜗螺旋神经节细胞内的总SOD活性，可能因为噪声能增加细胞中的超氧阴离子而对其产生毒性影响，银杏叶提取物则能提升SOD活性，减少自由基的产生，从而拮抗噪声的损伤作用。

丙二醛(MDA)含量的高低反映细胞受自由基攻击的严重程度。本实验中噪声组耳蜗螺旋神经节细胞内的MDA浓度显著提高，提示噪声能增强耳蜗螺旋神经节细胞内的脂质过氧化反应，使细胞受氧自由基的损伤。而银杏叶提取物能抑制噪声暴露后大鼠螺旋神经节细胞中MDA 的生成，使MDA含量减少，从而减轻耳蜗的损害，保护听功能。

本研究发现噪声性耳蜗损伤时耳蜗螺旋神经节细胞的总SOD活性降低，MDA含量升高，提示由脂质过氧化反应引发的自由基损伤是耳蜗噪声性损伤的重要原因。银杏叶提取物含有黄酮类化合物，可能是通过SOD酶而阻断脂质过氧化反应，直接清除自由基，限制了MDA 的生成。因此，该药物可能具有清除自由基和抑制脂质过氧化从而拮抗噪声性耳蜗损伤的作用。其作用机制可能是：①清除氧自由基，减少螺旋神经节细胞膜脂质过氧化，抑制羟自由基所致神经细胞膜蛋白构象的改变，保护膜功能；②保护神经突触体摄取递质功能免受氧自由基的损害；③ 影响自由基所致的基因表达变化，从而对自由基所致的细胞凋亡或坏死有一定防护作用[6]。但是用药组和正常对照组结果也存在显著差异，说明该药物对耳蜗的保护作用不完全，有一定局限性。

4 参考文献

1 谢鼎华，杨伟炎，韩德民,主编.听力与耳聋基础和临床现代进展[M].长沙：湖南科学技术出版社,2007.91～97，183～187.

2 Henderson D,Bielefeld EC,Harris KC,et al.The role of oxidative stress in noise-induced hearing loss[J].Ear Hear,2006,27:1.

3 De Feudis F ,Drieu K.Ginkgo biloba extract (EGb761) and CNS fuctions: Bisic studies and clinical applications [J]. Curr Drug Targets,2000,1:25.

4 林浩东，王欢，陈德松，等.银杏叶提取物(EGb50)对大鼠坐骨神经再生的影响及其量效关系[J].中华显微外科杂志，2006，29：264.

5 周彬，徐平，杜波，等.噪声暴露大鼠耳蜗磷酸化c-Jun氨基末端激酶表达[J].中国耳鼻咽喉头颈外科，2007，14：535.

6 Smith JV, Luo Y. Studies on molecular mechanisms of Ginkgo biloba extract [J]. App Microbiol Biotechnol,2004, 64:465.