胚胎大鼠背根神经节摘取方法的研究*

王士杰 黄丽辉 雷雳 王鸿 范尔钟 李颖

1 首都医科大学附属北京同仁医院 北京市耳鼻咽喉科研究所 耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室(首都医科大学)(北京 100005)

背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)又称脊神经节，是躯体和内脏感觉的初级中枢，富含感觉神经元[1]。动物实验研究结果表明[2]，将背根神经元植入耳蜗后，可以替代受损的感觉上皮并与螺旋神经节细胞形成连接，具有初步的传导功能，这为临床治疗感音神经性聋带来了希望。但采用文献报道[3～7]的传统摘取方法，操作难度相对较大，获取神经节数量相对较少。本研究探索了一种快速简便、实用性更强、效果更佳的背根神经节摘取方法，为神经元的体外培养和耳蜗移植研究奠定基础，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 手术器械与动物 Olympus体视显微镜1台、组织镊1把、组织剪1把、蚊式钳1把、游丝镊2把、眼科剪一把、直径10 cm培养皿1个、与培养皿面积相符的硅胶1块、注射针头4个、怀孕17～18天的Wistar大鼠4只(共有胚胎大鼠50只)。

1.2 方法

1.2.1 胚胎大鼠的获取 将怀孕17～18天的Wistar大鼠放入装有乙醚的容器中进行麻醉，待麻醉成功后颈椎脱臼快速致死。在大鼠下腹部“T”型剪开皮肤及皮下组织，含有胚胎的“Y”型子宫显露，剪开子宫及胎膜，取出胚胎大鼠。实验分次进行，共使用4只孕鼠，获得了50只胚胎大鼠。分别以传统方法和新方法各对25只胚胎大鼠摘取背根神经节。

1.2.2 传统方法摘取胚胎大鼠背根神经节 剪除胚胎鼠的头部、四肢以及腹部，获取胚胎鼠的脊柱，然后将脊柱放入培养皿内，在体视显微镜下打开椎管及摘取神经节。首先去除脊柱背侧的皮肤及皮下组织，显露椎骨。然后用游丝镊轻轻逐个离断椎弓，暴露椎管及脊髓。最后小心牵起脊髓，神经节从椎间孔被带出，然后逐个摘取(图1)。

图1 传统方法摘取背根神经节 方框内为背根神经节，黑色箭头所指为脊髓，黄箭头所指为椎骨

图2 直接固定打开椎管取出脊髓后 蓝箭头所指为神经节，黄箭头所指为椎骨

1.2.3 直接固定打开椎管法摘取胚胎大鼠背根神经节 将胚胎鼠按俯卧位直接放于培养皿内的硅胶上，用注射针头固定其四肢。首先用眼科剪沿胚胎大鼠的背部正中线剪开皮肤(从尾椎至颈椎)，用游丝镊小心向两侧分离皮肤，使椎骨暴露，椎管轮廓清晰可见。然后将胚胎鼠移至体视显微镜下，用眼科剪沿椎管走向从尾椎至颈椎剪开椎骨，使脊髓充分暴露。然后用游丝镊轻轻将脊髓取出，清理剩余的脊膜组织，再用眼科剪修剪椎骨，扩大开口，使圆形或椭圆形神经节完全暴露。最后用游丝镊从椎间孔内将神经节逐个取出(图2)。

1.2.4 统计学方法 分别计算两种方法的用时和摘取的神经节数量。用SPSS统计软件，以t检验分析两组之间的差异，P<0．05为有显著性差异。

2 结果

两种方法摘取每只胎鼠平均用时、每只胎鼠平均获得的神经节数量、每分钟获得的神经节数量和每个神经节用时见表1，可见直接固定打开椎管法摘取每只胎鼠的平均用时及摘取每个神经节平均用时比传统方法短，每只胎鼠获得的神经节数量及每分钟获得的神经节数量多于传统方法，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 两种方法摘取背根神经节的平均用时及摘取数量

注：与传统方法比较，**P<0.01

3 讨论

背根神经节(DRG)位于椎管内，在脊髓两侧，分布在椎间孔中，其表面被膜与脊膜相延续。颈部神经节多呈梭形，胸、腰、骶节段的呈圆形或椭圆形，半透明、浅黄色[8]。由于其位置深在，体积细小，摘取有一定困难。而DRG取材时间长短是影响DRG细胞培养能否成功的关键因素：只有减少细胞离体时间，才能保证培养时细胞的活性，活性良好的细胞才能用于下一步的耳蜗移植。因此，快速有效的摘取方法是细胞培养乃至细胞移植成功的最根本的基础。

胚胎鼠背根神经节摘取大致分为三步，本研究在这三个方面对操作加以改进：第一步是脊柱的获取与固定。传统方法是只保留脊柱，将其余组织剪除，这样不容易固定，使操作难度增大；而剪除这些不必要组织，需要耗费一定的时间。本研究直接将胎鼠俯卧于硅胶上，用注射针头固定四肢，同时将组织镊从脊柱的腹侧插入，利用组织镊的弹性沿前后方向绷紧脊柱，起到进一步的加固作用，这样既节省了时间，又容易固定。第二步是打开椎管的方式。传统方法是用游丝镊小心离断椎弓，暴露脊髓，同时避免损伤脊髓，以免影响下一步的摘取。本研究直接用眼科剪沿椎管走向剪开椎管，不必顾忌脊髓的损伤，既简单，又省时。第三步是胚胎鼠背根神经节的摘取，传统方法是牵起脊髓，将神经节从椎间孔中带出，然后用游丝镊小心摘取，由于胎鼠脊膜质地稚嫩，牵起时，神经节不容易从椎间孔被带出，即使被带出，在摘取过程中，也极其容易断离。鉴于此，本研究直接将脊髓从椎管内取出，取出脊髓后，在椎间孔内可以清晰地看到神经节，非常容易摘取，既缩短了摘取所用的时间，又能获得更多数量神经节，极大的提高了摘取效率。

本研究改进了胚胎大鼠背根神经节的摘取方法，与传统方法相比，直接固定打开椎管法摘取1只胚胎大鼠平均用时缩短约5分钟，获得的神经节数量平均增加约10个；在相同的时间内可获得更多数量的背根神经节。如果细胞培养需要相同数量的神经节，直接固定打开椎管法可在更短的时间内获得足够数量的神经节，从而缩短细胞离体时间，在一定程度上减少了细胞的损伤，能使细胞保持较高的活性，为下一步的细胞培养乃至移植奠定良好的基础。

1 王丽琴，宋学琴，王晓娟，等.胚胎大鼠背根神经节细胞分离培养、纯化及生物学特性研究[J].细胞生物学，2003，25:320.

2 Hu Z,Ulfendahl M,Prieskorn DM,et al.Functional evaluation of a cell replacement therapy in the inner ear[J].Otol Neurotol,2009,30:551.

3 Passmore GM.Dorsal root ganglion neurons in culture:A model system for identifying novel analgesic targets?[J]. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods，2005,51 :201.

4 Tandrup T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival[J]. Journal of Neurocytology，2004，33:173.

5 Malin SA,Davis BM，Molliver DC.Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity[J]. Nature Protocols，2007，2 : 152.

6 熊南翔,赵洪祥,张方成.从大鼠活体取背根神经节及交感神经节的方法[J].中国比较医学，2006，16：367.

7 陈海亮,黄飞,张璐萍,等.背根神经节摘取方法的研究[J].中外医疗，2008，27：1.

8 杨安峰，王平．大鼠的解剖和组织[M]．北京：科学出版社，1985.159～l 89．