创伤弧菌FJ03-X2株培养条件的优化研究＊

许斌福,陈秀锦,刘晓东,林能锋,刘新华,刘景瑜,林天龙

创伤弧菌FJ03-X2株培养条件的优化研究＊

许斌福1,陈秀锦2,刘晓东1,林能锋1,刘新华1,刘景瑜1,林天龙1

目的 探讨创伤弧菌毒株FJ03-X2的优化培养。方法以创伤弧菌毒株FJ03-X2进行实验,研究摇瓶培养温度、接种量、培养基、初始p H值、溶解氧等因素对菌株生长的影响,确定最适培养条件为:TSB培养基初始p H值为7.0,适宜接种量10%,培养温度28℃,装液量25mL/250mL,转速180r/min。培养菌数可达8×109cfu/mL,生物量为25mg/m L。以 TSB为基础培养基,采用单因子和正交实验相结合的方法,确定最佳培养基主要成份为:葡萄糖0.2%、胰蛋白胨1.8%、大豆胨0.4%和玉米浆0.4%。以最佳培养基配方给菌体提供营养,在最适培养条件下培养,可以使培养液中的细菌生物量高达50mg/mL以上。结果得出创伤弧菌FJ03-X2的优化培养条件和培养基配方。结论国内首次优化鳗源创伤弧菌培养条件,并给出相关依据。

创伤弧菌;培养;优化

创伤弧菌(V ibrio vulnif icus)是一种低度嗜盐性弧菌,属于人鱼共患病病原,能导致人与鳗鲡产生败血症和严重伤口感染〔1〕。上个世纪70-80年代,曾让日本和欧美等国的鳗鲡产业遭受巨大的经济损失〔2〕;近五年来,我国沿海地区养殖的鳗鲡因创伤弧菌而引起发病也十分严重,临床上呈现急性和迁延性两种过程,养殖鳗鲡的创伤弧菌病可反复发作,造成严重经济损失。许斌福等〔3〕制备创伤弧菌ISCOM疫苗免疫鳗鲡预防创伤弧菌病,但疫苗的大规模研制必须面对高效培养的瓶颈问题,因此进行创伤弧菌发酵培养优化研究具有重大意义。

目前,国内外的创伤弧菌研究主要侧重于流行病学和致病机理〔4〕等方面,比较少关注疫苗的研制与开发,尤其是培养优化方面。而细菌培养工艺研究主要集中在大肠杆菌等工业微生物〔5〕,弧菌培养工艺至今少见报道。因此,本研究选用了毒力较强、免疫原性好〔6〕的鳗源创伤弧菌 FJ03-X2,以 TSB为基础培养基进行培养条件和培养基优化的研究,使培养液的活菌生物含量大幅提高,为创伤弧菌疫苗的产业化生产提供了理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基 FJ03-X2菌株为本室保存的创伤弧菌;平板培养基 TSA(W/V)(p H7.0):大豆胨0.3%,胰蛋白胨1.7%,NaCl 1.5%,K2HPO40.25%,葡萄糖 0.05%,琼脂 1.5%,0.7×105Pa湿热灭菌20 min。

鉴别培养基TCBS琼脂(购自杭州微生物试剂有限公司),取82g溶于1 000m L纯水,加热至完全溶解,冷却至50℃,倾注无菌平皿备用。

种子(基础)培养基 TSB(W/V)(p H7.0):大豆胨0.3%,胰蛋白胨 1.7%,NaCl 1.5%,K2HPO40.25%,葡萄糖 0.05%,0.7×105Pa湿热灭菌20 min。

1.2 培养方法 从新鲜鉴别培养基 TCBS接种一环单菌落于50m L种子培养基 TSB中,摇床(28℃,180r/min)培养16h;根据试验设计,从种子瓶接种至培养液摇床(转速180r/m in)培养后,测定结果。

1.3 分析方法 p H值的测定:梅特勒-特利多320型p H测定仪。

细菌计数和OD595值测定:平板培养基 TSA涂布法活菌计数和紫外分光光度计(上海天美UV 1102)测定 OD595值。

生物量的测定:称量干净离心管,取20m L培养液至离心管内10 000 r/m in离心10m in,倒干上清液再称重,由前后的质量差与原体积之比即为生物量。

2 结 果

2.1 菌株中后期生长曲线 采用平板涂布方法进行活菌计数 ,在培养时间 16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、72h各取一次样。做出菌株的中后期生长曲线如图1所示。从图1可知,当培养时间达到20～28h左右时,菌种生长基本处于稳定期,28h菌数峰值近80×108cfu/m L;32h之后细菌进入衰老死亡期,72h菌数仅为1.25×106cfu/mL。

图1 FJ03-X2菌株中后期生长曲线Fig.1 The growth curve of strain FJ03-X2

2.2 菌株数量与(10×)OD595的关系 稀释菌液,分别测定菌液的(10×)OD595值与数量(108cfu/mL),得出活菌数量与(10×)OD595值的相关关系(图2)。图2显示活菌数量与(10×)OD595值基本呈线性关系,添加趋势线可以换算出细菌数量与(10×)OD595值之间的函数公式,函数公式为:y=0.0768x+0.0761,其中 y代表(10×)OD595值;x代表细菌数量(108cfu/m L)。

图2 FJ03-X2活菌数量与(10×)OD595值的关系Fig.2 The curve of strain FJ03-X2 between quan tity and(10×)OD595

2.3 培养温度 经不同温度培养细菌并进行细菌性能试验,结果显示适宜培养温度为28℃(另文报道)。

2.4 培养初始p H值 在基础培养基 TSB组成不变的前提下,将培养基的初始p H值分别调节为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,然后接种培养。采用细菌(10×)OD595值间接测定培养液中的活菌含量,p H值对菌株FJ03-X2的影响如图3所示。由此可知,该菌最适生长p H值为7.0～7.5。

图3 培养基pH值的确定Fig.3 The effects of pH value on the growth of strain FJ03-X2

2.5 接种量 在基本培养条件前提下,改变接种量,使接种量分别为 0.10%、0.50%、1.00%、5.00%、10.00%,采用(10×)OD595值间接测定培养液中的细菌数量。接种量与培养液细菌数量(10×)OD595值的关系如图4所示,结果表明不同接种量对创伤弧菌的培养影响不显著,综合考虑,适宜接种量为10%。

2.6 溶氧对生长的影响 溶解氧是需氧菌培养的必备条件,摇瓶装液量的多少直接影响氧的传递。本实验在基本培养条件前提下,改变装液量,使装液量分别为:200/500 m L(铝箔和牛皮纸),200/500 mL(八层纱布),100/500 m L(铝箔和牛皮纸),100/500 m L(八层纱布),50/250 mL(铝箔和牛皮纸),50/250 m L(八层纱布);25/250 mL(八层纱布),然后接种培养。同样采用(10×)OD595值间接测定培养液中的细菌数量。菌株FJ03-X2对氧气的需求情况如表1所示。从表中可知,装液量为25/250 mL(八层纱布)时,培养液中的细菌(10×)OD595值最高;结果显示,菌株FJ03-X2是需氧型。

图4 接种量对菌体生长的影响Fig.4 The effects of inoculum size on the growth of strain FJ03-X2

表1 溶氧对菌体生长的影响Tab.1 The effects of oxygen on the growth of strain FJ03-X2

2.7 培养基优化

2.7.1 碳源的优化 基础培养基的碳源葡萄糖分别配制为 0.05%(对照)、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%,制成培养基后接种培养,用(10×)OD595值间接测定培养液中的细菌数量并测定p H值,结果见图5。从图中可以看出,细菌数量与产物p H值波动趋势几乎完全一致,葡萄糖(p)对创伤弧菌生长影响比较敏感,最适合创伤弧菌 FJ03-X2生长的碳源是 0.2%葡萄糖;当葡萄糖为 0.4%、0.8%、1.6%时,培养液中的细菌(10×)OD595值明显偏低、产物p H值也异常低。

2.7.2 氮源的优化 基础培养基中的胰蛋白胨分别设为 1.7%(对照)、1.2%、0.8%、0.4%和大豆胨0.6%、0.3%(对照)、0.15%以及 200%TSB(但氯化钠保持1.5%);结果(见表2)显示胰蛋白胨(y)和大豆胨(d)含量与细菌(10×)OD595值呈正相关关系;但200%TSB细菌(10×)OD595值不高,说明配方之间有比例因素。

图5 碳源对培养的影响Fig.5 The effects of carbon on the growth of strain

表2 氮源对菌体生长的影响Tab.2 The effects of nitrogen sourceson the growth of strain FJ03-X2

2.7.3 无机盐的优化 基础培养基中磷酸氢二钾分为 0.25%(对照)、0.1%、0.05%,细菌 (10 ×)OD595值分别为 0.555、0.547、0.533;结果显示:不同浓度的碳酸氢二钾的培养基培养FJ03-X2,细菌(10×)OD595值差异不明显。

2.7.4 生长因子的优化 玉米浆和酵母膏均富含生长因子,本实验是在基础培养基上添加玉米浆和酵母膏,研究其对菌株 FJ03-X2的生长促进作用;试验分组为分别添加酵母膏 0.25%、0.10%、0.05%、玉米浆 0.25%、0.10%、0.05%、空白对照(未添加),细菌(10×)OD595值分别为 0.516、0.500、0.491、0.520、0.509、0.523、0.484;从结果可知,添加玉米浆(y)和酵母膏(j)均能促进细菌生长,细菌(10×)OD595值均比空白组(即未添加)显著增加;酵母膏含量与细菌(10×)OD595值呈正相关关系,可能与酵母膏本身蛋白含量高也有关系;其中玉米浆的最佳添加量为0.05%。

2.7.5 正交实验 培养基中各组分之间有一定的内在关系,为寻找它们之间最恰当的配比,在研究了碳源、氮源、无机盐和生长因子等单因子对菌株FJ03-X2生长的影响以后,采用正交实验的方法研究这些因素对菌株生长的综合作用,以进一步完善培养基中各组分的功能,提高培养液的生物量。以葡萄糖(0.18%、0.20%、0.22%)、胰蛋白胨(1.2%、1.5%、1.8%)、大豆胨(0.2%、0.4%、0.6%)和玉米浆(0.2%、0.4%、0.6%),磷酸氢二钾 (0.15%、0.20%、0.25%)、氯化钠(1.0%、1.5%、2.0%)、磷酸铁 (0.0005%、0.001%、0.002%)和酵母膏(0.05%、0.1%、0.2%)作为培养因素,每个因素各选取三个水平,并按L9(34)正交表设计9组摇瓶培养实验,每组做两个平行。正交实验的因素与水平和实验结果分析见表3。

表3 正交实验结果分析表Tab.3 The resultsand statistic analysis table of orthogonal trial

由实验Ⅰ极差可知,A的极差最大,C的极差最小;由实验Ⅱ极差可知,D的极差最大,F的极差最小。极差越大,反映该因素水平变动时,总指标变化越大,也就是该指标对综合指标的影响越大。因此,按极差大小顺序排列为A>B>D>C;H>G>E>F。据表2可知,菌株 FJ03-X2最佳培养基配方为A2B3C2D2E2F3G3H3。并通过优化 TSB培养基培养创伤弧菌生物量高达50 mg/mL以上;而对照组基础TSB培养基培养生物量约为25 m g/m L。

3 结 论

由实验可知,培养基的初始p H值、溶氧状况和培养基的组成等对菌株的生长有很大的影响。适合创伤弧菌FJ03-X2菌株生长的最佳条件是:培养基初始p H值为7.0,接种量10%(相对摇瓶装液量),培养温度28℃,装液量25m L/250 mL。通过单因子分析和正交实验,确定出创伤弧菌 FJ03-X2优化培养基主要成分为:葡萄糖2g/L、胰蛋白胨18g/L、大豆胨4g/L和玉米浆4g/L。通过优化培养基培养创伤弧菌生物量可实现翻番,为疫苗大规模生产奠定了物质基础。采用20L发酵罐补料培养24-28h,结果生物量可高达100-150 mg/m L。

〔1〕CerdaÁ-CueÂllar M,Permin L,Larsen JL.Comparison of selective media for the detection of Vibrio vulnificus in environmental samples〔J〕.Journal of App lied Microbiology,2001,91:322-327.

〔2〕Biosca E G,Amaro C,Esteve C,et a1.First reco rd of Vibrio vulnificus biotype 2 from diseased European eel,Anguilla anguilla〔J〕.J Fish Dis,1991,14:103-109.

〔3〕许斌福,陈秀锦,俞伏松,等.创伤弧菌 ISCOM疫苗的免疫学效应研究〔J〕.中国人兽共患病学报,2007,23(11):1075-1078.

〔4〕吴斌,卢中华.创伤弧菌感染的致病机制研究现状〔J〕.中国急救医学,2004,24(11):834-835.

〔5〕李寅,高海军,陈坚.高细胞密度发酵技术〔M〕.北京:化学工业出版社,2006,(6):229.

〔6〕许斌福,林天龙,董传甫,等.鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定〔J〕.中国人兽共患病杂志,2005,21(11):995-998.

Optim ization on fermentation of Vibrio vulnif icus FJ03-X2

XU Bin-fu,CHEN Xiu-jin,L IU Xiao-dong,L IN Neng-feng,L IU Xin-hua,L IU Jing-yu,L IN Tian-long
(Institute of B iotechnology,Fujian Academ y of A gricultural Sciences,Fuzhou 350003,China)

The effects of culture condition and media on the grow th of strain Vibrio vulnificus FJ03-X2 were studied in the experiment.The optimized fermentation conditions were as below:28℃,7.0 p H value of medium,10%inoculum size,50 mL medium per flask(250 mL),and 180r/m rotate.The optimized fermentation culture medium for strain FJ03-X2 was obtained after analyzing the effects on single elements of themedium(carbon sources,nitrogen sources,mineral and grow th facto r,respectively)for the grow th of strain and the relationship between each element.Themost optimal prescription for fermentation was composed of 0.2%glucose,1.8%tryp tone,0.4%soya pep tone and 0.4%co corn steep liquo r.The highest biomass concentration obtained in the experiments was above 50 mg/mL.

Vibrio vulnificus;fermentation;op timize

S941.42

A

1002-2694(2010)11-1008-04

＊国家863项目(2006AA 100308);福建省科技重点项目(2008N 0023);农业部公益行业专项(nyhyzx07-043);福建省自然基金项目(2008J0057);福建省水产病害防治技术工程研究中心项目(2009N2003)

林天龙,Email:lint05@163.com

1.福建省农业科学院生物技术研究所,福州 350003;

2.福建省疾病预防控制中心,福州 350001

2010-05-25;

2010-09-01