紫杉醇联合染料木黄酮对人肝癌细胞株 SMMC-7721的作用

王英婷,黄燮南,王淑兰

(1.遵义医学院药理教研室,贵州 遵义 563003;2.焦作市五官医院,河南 焦作 454150）

紫杉醇联合染料木黄酮对人肝癌细胞株 SMMC-7721的作用

王英婷1,2,黄燮南1,王淑兰2

(1.遵义医学院药理教研室,贵州 遵义 563003;2.焦作市五官医院,河南 焦作 454150）

目的利用中效原理体外定量分析紫杉醇及染料木黄酮联合应用对人肝癌细胞株SMMC-7721的作用。方法采用MTT法观察两种药物单用及合用对肝癌细胞株SMMC-7721的抑制率,然后用中效方程计算各自的中效浓度,并计算两种药物合用时的合用指数(CI）。结果两种药物单独使用时随着药物剂量的增加,其效应也增加,紫杉醇的中效浓度为 8.912μmol/L,染料木黄酮的中效浓度为 163.680μmol/L。两种药物合用时的中效浓度为 58.340μmol/L。大剂量合用(大于中效浓度）时 CI＜1,表示协同;小剂量合用(小于中效浓度）时CI＞1,表示拮抗。结论紫杉醇联合染料木黄酮对人肝癌细胞株SMMC-7721有抑制作用,两种药物大剂量合用时具有协同作用,小剂量合用时则相互拮抗。

肝癌细胞;紫杉醇;染料木黄酮;中效原理

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞株 SMMC-7721由本院微生物教研室提供,然后由本实验室传代。主要药品和试剂:染料木黄酮(Sigma公司）,紫杉醇注射液(上海华联制药有限公司）,RPMI-1640培养基(美国 Gibco公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物浓度设计 人肝癌细胞株SMMC-7721用含体积分数 10%小牛血清的 RPMI-1640培养基(内含质量分数 0.1%青霉素、链霉素）培养,置于 37℃、体积分数 5%CO2培养箱内孵育备用。先将紫杉醇注射液稀释成 1 g/L的母液,临用前将该母液用生理盐水稀释成实验浓度 1.315、2.630、5.260、13.170、26.340μmol/L。染料木黄酮用 DMSO配成1 mol/L的母液,于 -20℃保存,临用时用培养基稀释,使 DMSO＜0.01%,实验浓度为 11.25、22.50、45.00、90.00、180.00 μmol/L。

1.2.2 MTT法检测药物效应[4]取对数生长期的SMMC-7721细胞,用培养基调整细胞的浓度为 5×104个/L的细胞悬液,在 96孔培养板内每孔加入 200μL进行培养。实验设试剂对照组、肿瘤细胞阴性对照组及各种药物组。将两种单药的 5个不同浓度分别加在96孔板内,每孔加药量 20μL,每个剂量 3个平行孔,重复 3次。两种药物合用比例为 1∶1,每孔加药总量20μL(每种单药浓缩 1倍各加 10μL）。在 CO2培养箱内培养 48 h后,用自动酶标读数仪(美国 Bio-Rad-550型,波长 492 nm）测定每孔的 OD值。

1.3 结果判定 fa=1-(实验组平均 OD值/对照组平均 OD值）×100%,用自动酶标仪测得的 OD492值进行计算,然后按中效方程 fa/fu=(D/Dm）m计算中效浓度,其中 fa为抑制率,非作用部分 fu=1-fa,D为药物浓度,m为斜率,Dm为中效浓度(即产生 0.5效应时的药物浓度）。对中效方程 fa/fu=(D/Dm）m两边取对数,logfa/fu=mlogD-mlogDm。设 Y=logfa/fu,X=logD,a=-mlogDm,b=m;代入中效方程 Y=bX-a。根据该公式计算出两种药物单用及合用时各自的中效浓度 Dm(logDm=-a/m）;再计算出单用及两种药物合用在各种效应时的合用指数(combination index,CI）,CI=D1/DX1+D2/DX2+α(D1D2/DX1DX2）,其中可由 fa/fu=(D/Dm）m求得 D=Dm(fa/fu）1/m,D1、D2为两种药物合用产生 X效应时两者各自所需浓度,DX1、DX2为两种药物单用产生 X效应时各自的浓度,分别可由 DX=Dm1(X/1-X）1/m1,DX2=Dm2(X/1-X）1/m2求出。α=0为两种作用机制不同的药物,α=1为作用机制相同的药物。CI＜1表示协同,CI=1表示相加,CI＞1表示拮抗。由于紫杉醇及染料木黄酮为作用机制不同的药物,故 α=0。

2 结果

2.1 紫杉醇及染料木黄酮单用及合用时的指数 两种药物单用及合用时,随着药物浓度的增加,其效应也增加。根据上述公式,计算两种药物单用及合用时的抑制率 fa,以及不同抑制率 fa时斜率 m、中效浓度 Dm和相关系数 r。以抑制率 fa为横坐标,CI为纵坐标作量效曲线,进而判断两药在不同效应时各自所需药物浓度之间相互作用是否为协同、相加还是拮抗。详见表 1～3,图 1。

2.2 染料木黄酮及紫杉醇合用时的中效浓度 紫杉醇及染料木黄酮合用时的中效浓度为58.340μmol/L,当合用效应在 0.500时,CI为 1.00,说明两种药物在该效应时的实际浓度分别为 52.210、6.120μmol/L。当合用效应 fa分别为 0.900、0.800、0.700、0.600、0.550、0.500、0.400、0.300、0.200、0.100时,对应的CI分别为 0.443、0.586、0.718、0.852、0.927、1.000、1.197、1.450、1.845、2.730。详见表 2。

表 1 染料木黄酮及紫杉醇不同浓度单用及合用时的抑制率fa(n=9）

表 2 染料木黄酮及紫杉醇单用及合用时的各种指数

图 1 染料木黄酮及紫杉醇合用时的量效曲线

3 讨论

紫杉醇是国际上公认的抗瘤效果好、抗瘤谱广的一线抗肿瘤药物[5],因其能使微管蛋白和组成微管蛋白的二聚体失去平衡,促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚,从而阻止肿瘤细胞的生长。尽管临床上针对不同肿瘤已形成一系列联合化疗方案,但仍存在较严重的骨髓抑制、神经毒性和肌肉毒性[6-7]。因此,寻找能与紫杉醇联合应用降低其剂量的药物具有重大意义。

染料木黄酮为异黄酮类化合物,属于活性较弱的植物雌激素,广泛存在于豆科植物中。近年来国内外大量研究证实,染料木黄酮具有广泛的抗肿瘤活性,可抑制多种肿瘤细胞的生长和肿瘤血管的生成,加强多种细胞毒性抗肿瘤药物的抗肿瘤作用,被认为是颇具前景的抗肿瘤药和抗肿瘤辅助药[8]。

本实验结果显示,染料木黄酮与紫杉醇在体外单用时,对 SMMC-7721肝癌细胞均有抑制作用,且有量效关系,其相关系数 r分别为 0.973、0.998。这表明染料木黄酮与紫杉醇对肝癌细胞在体外都有抗增殖作用。

从染料木黄酮及紫杉醇合用时的效应和 CI的关系图可以看出,两种药物在高效应时(大于中效剂量）为协同作用(CI＜1）,在低效应时(小于中效剂量）为拮抗作用(CI＞1）,在效应为 0.5时,CI=1,说明两种药物在该效应剂量时相互作用为增加。而且两种药物在合用时的中效浓度均低于单用时的中效浓度。

联合用药是肿瘤化疗的基本原则之一,联合用药可以选择高效应时最小剂量进行,进而减少药物的毒副反应。染料木黄酮及紫杉醇在体外合用时可以协同抑制人肝癌细胞株 SMMC-7721的增殖,降低单用时的剂量,从而降低药物的毒副反应。本研究为两种药物联合用于肝癌的治疗提供了重要线索。

[1] 贾林,李瑜元.染料木黄酮(genistein）对肿瘤的防治作用及其机制[J].广州医药,2000,31(1）:12-13.

[2] Satoh H,Ishikawa H,Fujimoto M,et al.Angiocytotoxic therapy in human non-small cell lung cancer cell lines--advantage of combined effects of TNP-470 and SN-38[J].Acta Oncol,1998,37(1）:85-90.

[3] Chou TC,Talalay P.Quantitativeanalysisof dose-effect relationships:the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors[J].Adv Enzyme Regul,1984,22:27-55.

[4] 汤为学,骆云鹏,王瑞雪.人实体瘤抗癌药物敏感试验 MTT法的建立[J].重庆医科大学学报,1992,17(2）:103-108.

[5] 匡燕.紫杉醇的研究进展[J].西南军医,2004,6(2）:35-37.

[6] 刘本叶,叶和春,李国凤.抗癌新药紫杉醇的研究概况[J].植物学通报,1995,12(3）:8-14,27.

[7] 王海燕,李运曼,刘国卿.紫杉醇抗癌机制研究进展[J].药学进展,1999,23(4）:209-214.

[8] 孔令泉.染料木黄酮抗肿瘤作用研究进展[J].国外医学·肿瘤学分册,1999,26(5）:285-288.

The Effects of Paclitaxel Combined with Genistein on the Hepatoma-Cellular Strain SMMC-7721

Wang Yingting1,2,Huang Xienan1,Wang Shulan2
(1.Department of Pharmacology,ZunyiMedical College,Zunyi 563003,China;2.Jiaozuo Five Sense Organs Hospital,Jiaozuo 454150,China）

Objective To analyze the effects of paclitaxel and genistein on the hepatoma-cellular strain SMMC-7721 by using median-effect principle,quantitively in vitro.MethodsThe inhibitions of paclitaxel,genistein or paclitaxel combined with genistein on the hepatoma-cellular strain SMMC-7721 weremeasured by MTT assay,and the correspondingmedian effective concentrationswere calculated with medianeffect equation;when the various concentrations of the two drugs used,the combination indexes(CI）were calculated.ResultsThe effects of the individual drugs were increased with a concentration dependentmanner.The median effective concentration of paclitaxel was 8.912 μmol/L and thatof genistein was 163.680μmol/L.However,when the two drugs used in combination,themedian effective concentration was 58.340μmol/L.The CIwas＜1 at thehigher concentration(more thanmedian effective concentration）combination(synergism）,and the CIwas＞1 at the lower concentration(less than median effective concentration）combination(indicating antagonism）.ConclusionThe effects of paclitaxel combined with genistein on hepatoma-cellular strain SMMC-7721 are inhibition,synergistic at the high concentration combination and antagonistic at the lower concentration combination.

hepatoma cell;paclitaxel;genistein;median-effect princip le染料木黄酮是异黄酮类化合物,属于活性较弱的植物雌激素。近年来大量的流行病学、细胞培养和动物实验研究证实染料木黄酮对肿瘤具有预防、治疗和抑制转移作用[1]。另外,染料木黄酮对环磷酰胺、表阿霉素、5-Fu等细胞毒药物具有增效作用[2]。紫杉醇为抗瘤谱较广的一线抗肿瘤药,但染料木黄酮与紫杉醇联合应用还未见报道,本实验在体外观察两者单用及合用时对人肝癌细胞株 SMMC-7721生长的作用,并根据中效原理[3]定量分析两种药物的相互作用。

R 735.7;R 73-36

A

1673-5412(2010）05-0372-03

王英婷(1971-）,女,硕士,主要从事肿瘤药理学研究。E-mail:tingwang19@yahoo.com.cn

黄燮南(1943-）,男,教授,主要从事肿瘤药理学研究。E-mail:huangxienan@yahoo.com.cn

2010-09-06）