环境化学致癌物联苯胺和六氯苯对大鼠肝线粒体酶活性的影响

吴明和，周锡昌，梅秀丽，梅启明，2，#，郭鹏

1.武汉大学生命科学学院，武汉430072

2.武汉大学园林与环卫中心，武汉430072

3.武汉大学药学院，武汉430072

1 引言（Introduction）

联苯胺（Benzidine，学名：4,4-二氨基联苯）是联苯的衍生物之一，目前作为染料合成的中间体被广泛应用于纺织印染业中.联苯胺可与血红蛋白结合成高铁血红蛋白，使血红蛋白与氧结合能力下降；可导致人体急性或慢性中毒，记忆力严重下降，长期与该类物质接触可引起癌症（International Agency for Research on Cancer, 1982）.近年来，人体因联苯胺引起的膀胱癌、肝癌、肾癌和胆管癌等疾病已屡有报道（Choudhary, 1996）.

六氯苯（1,2,3,4,5,6-Hexachlorocyclohexane，学名：六氯化苯）是一种易挥发的持久性有机污染物（International Agency for Research on Cancer, 1982）.六氯苯作为农作物的杀虫剂和氯化物产品生产过程中的副产物和杂质进入环境，并广泛残留于各环境介质中.六氯苯可在人体和各种生物体内累积（Courtney,1979;Billi de Catabbi et al., 2000），其毒性作用的主要靶器官是动物的肝脏.六氯苯的致突变性研究发现，暴露六氯苯引起的卟啉症有引起原发性肝癌的倾向（Axelson,1986）.

目前有关联苯胺和六氯苯的毒性作用研究已取得了一些进展（刘红玲等，2007;戴捷和杨慧慧，2009），但其毒性作用机制研究很少深入到细胞器水平，对哺乳动物肝脏线粒体酶活性的影响尚鲜有报道.为此，我们通过体内染毒方式建立毒性作用动物模型，研究了联苯胺和六氯苯对大鼠肝线粒体抗氧化物酶及呼吸代谢和能量转换酶——超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、细胞色素C氧化酶（COX）及钙、镁 ATP酶（Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase）活性的影响.对联苯胺和六氯苯在线粒体水平上的毒性作用进行探讨，将为进一步深入研究其毒性机制提供实验依据.

2 材料与方法（Materials and methods）

2.1 主要试剂

联苯胺、六氯苯、邻苯三酚、核黄素、还原型细胞色素C、K3Fe（CN）6、1-萘酚、ATP钠盐、甘露醇、三羟甲基氨基甲烷（Tris）均为分析纯，购自上海试剂公司产品.考马斯亮蓝G-250，购自华美试剂公司，为Sigma进口分装.其余试剂均为国产分析纯.

2.2 大鼠的分组及处理

选用健康成年二级SD大鼠，雌雄不分，体重（260±30）g左右，随机分成4组，分别为对照组和3个联苯胺处理组或3个六氯苯处理组，每组10只.其中3个联苯胺处理组按大鼠体重分别以50、100、200mg·kg-1的联苯胺溶液（配制：先将2g联苯胺用5mL冰醋酸充分溶解后再用50mL灭菌双蒸水稀释）进行腹腔注射；3个六氯苯处理组按大鼠体重分别以 200、400、800mg·kg-1的六氯苯溶液（配制80mg·mL-1六氯苯水溶液（母液），土温-20助溶，其含量为1.0%，注：最高浓度组大鼠的注射剂量不超过10mL·kg-1）进行腹腔注射，每天1次，共25d.对照组注射等体积量的生理盐水.

2.3 大鼠肝脏线粒体的提取及线粒体酶样品液的制备

采用文献方法进行（梅启明和朱英国，1990;梅启明等，2004）.

2.4 酶活性测定及数据处理

2.4.1 线粒体蛋白含量测定

线粒体蛋白定量采用Lowry法测定（李如亮，1997）.

2.4.2 SOD酶活性测定

采用邻苯三酚自氧化法测定（谢卫华等，1988），酶活性单位以U·mg（pro）-1表示.

2.4.3 GSH-Px活性测定

采用DNTB直接法测定（夏奕明和朱莲珍，1987），酶活性单位以U·mg（pro）-1表示.

2.4.4 COX活性测定

COX酶活性测定采用分光光度法（Smith, 1955）测定.测定的酶样品中加入10mmol·L-1pH 7.0磷酸钾缓冲液1.5mL、酶液10μL（含线粒体蛋白50μg）、加双蒸水至2.9mL；对照含同量磷酸钾缓冲液和酶液、加入 100mmol·L-1K3Fe（CN）630μL、加双蒸水至 2.9mL；30℃温育 5min，加入0.18mmol·L-1还原型细胞色素 C 0.1mL,直接测定还原型细胞色素C被氧化的速度（即立即记录550nm波长下光谱吸收值（A）下降的速度），计算COX活性，以一级反应速度常数K表示酶活性，酶活性单位以K［min-1·mg（pro）-1］表示.

2.4.5 Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性测定

采用微量定磷法测定（Furui,1990）.酶活性单位以μmolPi·h-1·mg（pro）-1表示.

3 结果与分析（Results and analysis）

3.1 联苯胺对SOD、GSH-Px、COX、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的影响

SOD、GSH-Px、COX、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的检测结果见表1.

表1 联苯胺对大鼠肝脏线粒体酶活性的影响Table 1 Effect of benzidine on enzyme activity of rat liver mitochonria

表1显示，在不同浓度联苯胺作用下，大鼠脏脏线粒体中SOD、GSH-Px和Ca2+-ATPase的活性随联苯胺作用浓度增加，呈现出先上升再下降趋势，在联苯胺的处理浓度为50mg·kg-1时酶活性最高，其中SOD、GSH-Px、Ca2+-ATPase分别为对照组的102.0%、126.0%和123.0%.表明大鼠肝脏线粒体对联苯胺的毒性作用存在应激反应.联苯胺浓度升高至200mg·kg-1时酶活性最低，其中SOD下降30.4%，GSH-Px下降27.1%，Ca2+-ATPase下降26.8%.而COX和Mg2+-ATPase的活性则是随联苯胺作用浓度增加一直呈现下降趋势，其中200mg·kg-1浓度处理组COX和Mg2+-ATPase的活性分别只有对照组的67.0%和48.8%.

3.2 六氯苯对SOD、GSH-Px、COX、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的影响

SOD、GSH-Px、COX、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的检测结果见表2.

表2显示，在不同浓度六氯苯作用下，大鼠肝脏线粒体中GSH-Px、COX和Ca2+-ATPase的活性随六氯苯作用浓度的增加，呈现先上升再下降趋势.COX和 Ca2+-ATPase在六氯苯处理浓度为200mg·kg-1时酶活性最高，其中COX为对照组的107.8%，Ca2+-ATPase为对照组的112.5%；GSH-Px在六氯苯处理浓度为400mg·kg-1时活性最高，其活性为对照组的122.2%.表明大鼠肝脏线粒体对六氯苯的毒性作用存在应激反应.六氯苯浓度升高至800mg·kg-1时酶活性最低，GSH-Px、COX和Ca2+-ATPase分别仅为对照组的 94.7%、70.9%和65.5%.而SOD和Mg2+-ATPase的活性则随着六氯苯作用浓度增加一直呈现下降趋势，至800mg·kg-1浓度处理组时，SOD和Mg2+-ATPase的活性分别只有对照组的75.5%和57.0%.

表2 六氯苯对大鼠肝脏线粒体酶活性的影响Table 2 Effect of 1,2,3,4,5,6-hexachlorocyclohexane on enzyme activity of rat liver mitochonria

4 讨论（Discussion）

接触联苯胺的职业性膀胱癌高危人群的原癌基因AN43基因的检出率及mRNA的定量PCR读数均明显高于对照组人群（秦逸秋等，1999）.抑癌基因谷胱甘肽s-转移酶GSTs基因型的分布在上海膀胱癌患者和联苯胺接触人群中显著低于一般人群（陈纪刚等，1999）.表明联苯胺可能对某些抑癌基因的表达具有阻遏作用而产生细胞毒性，对某些原癌基因的表达具有诱导激活的作用而使细胞产生癌变.在本实验中，联苯胺导致大鼠肝脏线粒体COX和Mg2+-ATPase活性持续下降，而SOD、GSH-Px和Ca2+-ATPase出现一定应激反应后活性同样持续下降.这表明联苯胺可能经体内代谢活化后，直接对线粒体DNA及其转录和翻译系统产生作用，使酶的合成受阻，活性氧自由基和脂质过氧化物大量产生.COX活性的降低表明电子传递过程已出现障碍，氧自由基的形成和泄漏的增加.由于联苯胺的毒性作用，线粒体已处于病理状态.一方面，在联苯胺毒性作用下，肝细胞线粒体氧自由基泄漏增加，线粒体内单价氧大量产生；另一方面，由于线粒体内单价氧大量产生，各类脂质过氧化产物大量增加，使SOD、GSH-Px过量消耗.脂质过氧化产物的大量增加导致Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性降低.线粒体膜钙泵、镁泵（Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase）活性减弱直接导致细胞内钙超载，也是导致线粒体膜电位降低、线粒体氧化磷酸化障碍，造成线粒体膜结构受损和细胞坏死的重要原因（Zydowo et al.,1985;Elimadi et al., 1997）.

动物的肝脏是六氯苯毒性作用的主要靶器官，六氯苯通过影响肝脏的血红素和膜磷脂代谢而引起卟啉血症，甚至肝癌的产生（Cochón et al., 1999）.六氯苯的致突变性试验研究发现，暴露六氯苯引起的卟啉症有引起原发性肝癌的倾向（Axelson,1986）.在本实验中，当六氯苯剂量浓度升高到800mg·kg-1时，COX和ATPase活性的下降幅度最大.分析认为，六氯苯可能经过两种途径对鼠肝细胞线粒体产生毒性.一方面，经体内代谢活化及-OH-自由基与苯环反应而大量产生活性氧自由基，并对线粒体DNA及其转录和翻译系统产生作用，使大鼠肝细胞线粒体COX合成被阻遏，酶的活性减弱.另一方面，由于线粒体COX活性被阻断和减弱而造成呼吸链障碍电子泄露增加，以致活性氧自由基和脂质过氧化物大量产生.结果是SOD、GSH-Px等功能酶被大量消耗，线粒体内膜被损伤，外膜钙泵活性降低，使线粒体及细胞内钙镁平衡紊乱，导致细胞凋亡和死亡.

本实验结果表明，线粒体内COX电子传递链的完善与否和SOD、GSH-Px的水平是决定线粒体内单价氧自由基泄漏多寡及各类脂质过氧化物产生的关键.在本实验中，联苯胺、六氯苯经体内代谢活化后，可能直接对线粒体DNA及其转录和翻译系统产生作用，使酶的合成受阻，由于线粒体COX代谢活性被阻断和减弱，以至呼吸链障碍和电子泄露增加，线粒体活性氧自由基和脂质过氧化物大量产生.超过线粒体SOD清除和GSH-Px的还原能力时，线粒体膜结构和功能受到损伤，线粒体正常的氧化磷酸化功能障碍，外膜钙泵活性降低，线粒体及细胞内钙、镁平衡紊乱.这可能是联苯胺、六氯苯等环境化学致癌物对线粒体损伤的主要机制.结果还表明，联苯胺、六氯苯等环境化学致癌物可能作为呼吸链阻碍剂，不仅影响呼吸链功能，而且促进活性氧自由基大量逸出线粒体，损伤细胞质和细胞膜，导致细胞恶变.

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