人诱导性多能干细胞的培养及鉴定

冯年花 ，谢 安 ，娄远蕾 ，阮琼芳 ，郭 菲 ，吴 珏 ，邓志锋 ，汪 泱 *

(1、南昌大学泌尿外科研究所；2、南昌大学研究生院医学部；3、南昌大学第二附属医院神经外科，江西南昌330006)

人诱导性多能干细胞的培养及鉴定

冯年花1，2，谢 安1，娄远蕾1，阮琼芳1，郭 菲1，吴 珏1，2，邓志锋3，汪 泱1*

(1、南昌大学泌尿外科研究所；2、南昌大学研究生院医学部；3、南昌大学第二附属医院神经外科，江西南昌330006)

目的建立稳定的人诱导性多能干细胞(iPS细胞)培养体系。方法取第3～5代的小鼠胚胎成纤维细胞，丝裂霉素C处理后用作饲养层。人iPS细胞接种于饲养层上生长，胶原酶消化或机械法传代。倒置显微镜下观察iPS细胞生长状态；观察拟胚体形成能力；RT-PCR检测iPS细胞多能性基因的表达情况。结果(1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为贴壁生长细胞，呈梭形或多角形。细胞增殖旺盛。(2)生长在饲养层上的人iPS细胞呈典型的克隆状生长。克隆呈圆形或椭圆形，边界清晰。克隆内细胞排列紧密，细胞体积小，核大，细胞核/质比高。RT-PCR结果显示人iPS细胞强表达多能性基因Oct4,Nanog,Sox2；去除饲养层后悬浮培养能形成拟胚体(EB)。结论本实验的培养体系适合人iPS细胞的培养，人iPS细胞能稳定增殖，保持自我更新及分化潜能。

人诱导性多能干细胞；细胞培养；饲养层

诱导性多能干细胞 (induced pluripotent stem cells,iPS细胞)是一种通过成体细胞重编程建立的多能干细胞，具有胚胎干细胞的特性，表达胚胎干细胞相关的多能性基因，能分化为三个胚层的细胞，移植到裸鼠体内能形成畸胎瘤[1,2]。由于可取自成体细胞，因此iPS细胞的使用可避免胚胎干细胞面临的伦理及免疫排斥问题，具有广泛的应用前景[2]。iPS细胞稳定培养体系的建立是其用于基础研究及临床疾病治疗的基础，具有重要的意义。本实验旨在建立稳定的iPS细胞培养体系，为iPS细胞的基础研究及临床应用奠定基础。

材料与方法

1 材料

1.1 实验动物及细胞系来源 清洁级孕12.5天Balb/c小鼠由南昌大学医学院动科部提供；人诱导性多能干细胞系iPS-S由中科院上海生化细胞所肖磊课题组惠赠[3]。

1.2 试剂 KnockoutTMDMEM培养基、KnockoutTM血清替代物(Serum Replacement)、高糖DMEM培养基、非必需氨基酸 (NEAA)、L-谷氨酰胺 (L-Glutamin)、-2-巯基乙醇(β-ME)、碱性成纤维生长因子(b-FGF)、Ⅳ型胶原酶， 以上均购自美国Invitrogen公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物有限公司；丝裂霉素C(MMC)和明胶(gelatine)购自美国Sigma公司；逆转录及PCR试剂盒购自美国Fermentas公司。

2 方法

2.1 培养基的配制 iPS细胞培养基：KnockoutTMDMEM+20%SR+1%NEAA+1mM L-glu+0.1mM β-ME+4ng/ml b-FGF；小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养基：高糖DMEM培养基+10%FBS+2mM L-谷氨酰胺。

2.2 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的原代提取 将健康成年Balb/c小鼠按照雄性和雌性1:2比例合笼，次日观察阴道栓，见栓当日记为孕0.5天(E0.5d)。取妊娠12.5d的孕鼠，无菌条件取出胚胎，剥离羊膜，去除头、四肢和内脏，用无菌PBS洗净血迹，眼科剪剪碎，加入0.125%EDTA胰蛋白酶37℃水浴消化3～5min后，轻轻吹散细胞，加入含血清培养基终止，静置，取上清，重复数次；收集上清，1200r/min离心5min，取沉淀，以105/ml的密度接种于T25的细胞培养瓶中，37℃、含5%CO2条件下培养。取状态良好的细胞冻存备用。

2.3 饲养层的制备 取第3～5代的MEF细胞，换上含10μg/ml丝裂霉素C的新鲜培养液继续孵育1.5～3h，用无菌 PBS 洗 5 遍，胰酶消化，以 5～10×105/ml接种于预先用0.1%的明胶处理1～2h的T25塑料培养瓶中，一周内使用。

2.4 人iPS细胞的传代培养

2.4.1 复苏 取出冻存的iPS细胞，放于37℃温水，使冰晶快速融化，逐滴加入10倍体积的iPS细胞培养基，轻轻吹打混匀，800r/min离心3min，弃上清，加入5ml新鲜iPS细胞培养基，再次离心，洗净冻存液中的DMSO和血清，用iPS细胞培养基重悬后接种于预先制备的饲养层上，每天换液。

2.4.2 传代 (1)Ⅳ型胶原酶消化传代法：待集落长满饲养层，用1mg/ml的Ⅳ型胶原酶消化15～20min，将集落吹下，加入3～5ml培养液，轻轻吹散成小集落，均匀接种于饲养层细胞上，37℃、含5%CO2条件下培养；(2)机械传代法：传代前在倒置相差显微镜下将要分离的克隆做好标记，无菌条件下用无菌巴氏管挑取标记好的克隆，机械分离至合适大小，挑至离心管中800r/min离心3min，收集细胞沉淀，新鲜培养基重悬，接种于预先制备的饲养层上，每天换液。

2.4.3 冻存 将消化下来的iPS细胞集落转移至离心管中，轻轻吹打至合适大小，800rpm离心3min，弃上清，加入预先配好的冻存液(70%培养基+20%血清+10%DMSO)，混匀，转移至冻存管，标记好名称、日期和代数，于冻存盒中-80℃过夜，次日转移至-196℃液氮罐中保存。

2.5 人iPS细胞的鉴定

2.5.1 RT-PCR检测多能性基因的表达 取状态良好的人iPS细胞克隆，Trizol法提取总RNA，RTPCR检测多能性基因Oct4，Sox2，Nanog的表达。使用Fermentas逆转录试剂盒，随机引物逆转录合成cDNA后进行PCR扩增，PCR反应条件如下：94℃预变性 5min，94℃变性 30s，退火 30s，72℃ 30s，72℃延伸10min，扩增30个循环。β-actin做内参。各引物序列及产物长度如下：Oct4：上游引物：CGAAGAGAAAGCGAACCAGTATC，下游引物：AGAACCACACTCGGACCAC ATC；Nanog： 上 游 引 物 ：GCAAAAAAGGAAGACAAGGTCC，下游引物：CCTTCTGCGTCACACCATTG；Sox2： 上 游 引 物 ：CCCCCGGCGGCAATAGCA，下游引物：TCGGCGCCGGGGAGATACAT；β-actin： 上 游 引 物 ：TCCTGTGGCATC CACGAAACT， 下 游 引 物 ：GAAGCATTTGCGGTGGACGAT。

2.5.2 拟胚体(EB)形成能力 将消化下来的iPS细胞集落移至一培养皿中，差速贴壁30min，去除剩余的饲养层细胞，收集悬浮细胞集落，用不含bFGF的iPS细胞培养基重悬，吹打至合适大小的细胞团，接种于低黏附的细菌培养皿中悬浮培养，隔天换液。

结 果

1 原代MEF的生长状态小鼠胚胎成纤维细胞为贴壁生长细胞，消化后2～3小时即贴壁并完全伸展，细胞呈梭形或多角形，胞浆饱满，立体感强，细胞核清晰。培养第二天可见培养液中漂浮较多的死亡细胞。细胞增殖旺盛，镜下可见较多圆形透亮的新生分裂细胞(图A)。一般2～3天细胞完全融合，以1:2～3传代，取第3～5代状态良好的细胞用于饲养层的制备。

2 人iPS细胞的生长状况及鉴定 iPS细胞呈典型的克隆状生长，克隆呈圆形或椭圆形，边界清晰，折光性好，高倍镜下形似鸟巢(图B)。克隆内细胞排列紧密，细胞体积较小，细胞核大、核仁清晰，细胞核/质比高。细胞增殖旺盛，一般每5～6d传代。RTPCR结果显示体外多次传代的iPS细胞仍高表达多能性基因 Oct4，Sox2，Nanog(图 C)。消化后的 iPS 细胞集落在低黏附培养板中悬浮培养能聚集成球生长，形成拟胚体。拟胚体内细胞间黏附紧密，各拟胚体边界清楚，胚体饱满，折光性好，悬浮生长于培养液中(图 D)。

讨 论

随着再生医学的兴起，干细胞成为研究的热点。iPS技术的建立是干细胞领域的又一重大突破，具有里程碑式的意义。稳定的iPS细胞体外培养体系是其应用于基础研究及临床疾病治疗的前提。本实验室培养的人iPS细胞具有和ES细胞类似的生长特性，传至35代仍能稳定增殖并保持未分化状态，强表达多能性基因Oct4，Sox2，Nanog，在去除饲养层之后能形成拟胚体，表现出干细胞的聚集生长特性。说明本实验的培养体系适合iPS细胞的稳定生长。

胶原酶消化法和机械传代法是两种常用的胚胎干细胞传代方法[4]，胶原酶适合消化生长状态良好，分化较少的克隆；机械法适合于克隆的纯化优选。前者操作方便，适合大批量扩增培养，但消化后集落的大小不易控制；后者工作量较大，时间较长，不适合大批量扩增培养，但能控制集落的大小。实际操作中可将二者结合，在不同阶段使用不同的方法进行传代。

在iPS细胞培养体系中，合适的饲养层细胞是维持其生长的必要条件。饲养层细胞是经过灭活处理的不再增殖的细胞，可以分泌一些生长因子，促进细胞增殖，抑制分化，从而保持干细胞的自我更新及高度未分化状态[5]。不同的饲养层分泌生长因子的能力不同[6]。饲养层细胞的好坏直接影响iPS细胞的生长状态。制备饲养层细胞最关键的步骤是灭活，比较常用的有两种方法，一种是射线照射法，另一种是丝裂霉素C处理法。处理的浓度和时间主要根据细胞的状态、密度进行调整[7]。本实验中采用丝裂霉素C处理法，一般10μg/ml处理1.5～3小时。我们曾将经10μg/ml的丝裂霉素C处理2、2.5、3小时的饲养层进行比较，发现处理2.5小时比较合适，此时MC对细胞的毒性最低，同时又达到最佳的灭活效果。饲养层细胞的密度对iPS的生长状态亦有影响[7,8]，细胞密度太高导致iPS细胞堆积生长，克隆中部细胞容易营养缺乏而死亡；密度太低易使iPS细胞分化，一般T25的培养瓶种植5～8×105细胞。此外，不同种属的饲养层细胞对iPS细胞的维持能力也不同[9，10]；饲养层细胞传代次数越多，其对iPS细胞的维持能力则越低[11]。

目前，多家实验室已成功建立iPS细胞系，但各实验室之间的培养体系存在些许差异，这在一定程度上影响了实验的重复性及稳定性。因此，建立稳定规范的iPS细胞培养体系有助于提供高质量细胞系，提高实验的真实性和准确性。

(致谢：感谢中科院上海生物化学与细胞生物学研究所肖磊课题组提供iPS细胞系)。

[1]Takahashi K.Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663～676.

[2]Boland M J,Hazen J L,Nazor K L,et al.Adult mice generated from induced pluripotent stem cells[J].Nature,2009,461(7260):91～94.

[3]Liao J,Wu Z,Wang Y,et al.Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS)cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors[J].Cell Res,2008,18(5):600～603.

[4]Richards M,Bongso A.Propagation of human embryonic stem cells on human feeder cells[J].MethodsMol Biol,2006,331:23～41.

[5]Saxena S,Hanwate M,Deb K,et al.FGF2 secreting human fibroblast feeder cells:a novel culture system for human embryonic stem cells[J].Mol Reprod Dev,2008,75(10):1523～1532.

[6]Eiselleova L,Peterkova I,Neradil J,et al.Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells[J].Int J Dev Biol,2008,52(4):353～363.

[7]Zhou D,Liu T,Zhou X,et al.Three key variables involved in feeder preparation for the maintenance of human embryonic stem cells[J].Cell Biol Int,2009,33(7):796～800.

[8]Michalska AE.Isolation and propagation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of mouse embryonic feeder layer cells[J].Curr Protoc Stem Cell Biol,2007,Chapter 1:Unit1C.3.

[9]Zhu W W,Li N,Wang F,et al.Different types of feeder cells for maintenance of human embryonic stem cells[J].Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao,2009,31(4):468～472.

[10]Lee J B,Song J M,Lee J E,et al.Available human feeder cells for the maintenance of human embryonic stem cells[J].Reproduction,2004,128(6):727～735.

[11]Camarasa M,Brison D,Kimber S J,et al.Naturally immortalised mouse embryonic fibroblast lines support human embryonic stem cell growth[J].Cloning Stem Cells,2009,11(3):453～462.

Culture and identification of human induced pluripotent stem cells

FENG Nianhua,XIE An,LOU Yuanlei,et al.Institute of Urology of Nanchang University,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo establish a stable culture system of induced pluripotent stem cells(iPS).MethodsMouse embryonic fibroblast cells of 3-5th passages were treated by mitomycin C and prepared as feeder layers.iPS clones were plated on feeder layers and cells were observed under invert microscope.iPS clones was passaged by collagenase digestion or mechanical method.Total mRNA were extracted and expression of pluripotentassociated genes were detected by RT-RCR.Results(1)Mouse embryonic fibroblast cells were tightly adherent to culture dish and showed a spindle or polygon shape.(2)iPS cells were maintained on inactivated feeder layer and formed condensed clones with clear borders.Cells in clones appeared high nucleus/cytoplasm ratio and predominant nuclei.All iPS cells strongly expressed Oct4,Nanog and Sox2.When feeder cells were removed,iPS cells formed embryoid bodies in suspension condition.ConclusionHuman iPS cells proliferated stablely and kept high self-renewal and differentiation potency in our lab culture system,so the culture system is suitable for the long term subculture of human iPS cells.

Human induced pluripotent stem cells;Cell culture;Feeder cells

R446.11+3,Q813.1+1,R392-33

A

1674-1129(2010)01-0006-03

国家自然科学基金(30960385)；江西省自然科学基金(2007GZY1470)

冯年花，女，江西吉安人，1987年1月出生，南昌大学医学院硕士研究生。

*通讯作者：汪泱，女，江西高安人，研究员，博士生导师，主要研究方向为干细胞与再生医学。

10.3969/j.issn.1674-1129.2010.01.003