四氯联苯对鸡外源原始生殖细胞迁移的影响

张易祥,金秀梅,李赞东*,刘 莉,采克俊,丁志丽 (.中国水产科学研究院湖州师范学院,细胞工程研究所,浙江 湖州 33000；.中国农业大学生命科学院,北京 00094)

多氯联苯(PCBs) 是联苯被氯原子取代后的产物,由于其脂溶性强,半衰期长,在环境中不易降解,易通过食物链富集在人和动物体内,已造成全球性的污染[1-2].实验表明,早期胚胎暴露于PCBs中会导致出生后发育异常,引起睾丸、附睾、前列腺和精细管损伤,精子质量下降[3].PCBs家族中的许多种类有雌激素作用,能干扰接触个体或其后代的内分泌功能,导致神经系统、免疫系统、生殖系统障碍[4-5].发育中的组织器官尤其对这类物质敏感,在动物发育的某些关键时期,一旦受到这些物质的影响,往往对其生殖系统造成不可逆转的损害,并具有遗传性[6].2,2',5,5'-四氯联苯(PCB 52)是 PCBs中的一种,被认为具有雌激素活性,可干扰动物的内分泌系统[7].

禽类原始生殖细胞(PGCs)是精子和卵子的祖细胞,其迁移伴随着高速增殖.这些细胞起源于胚胎外胚层,然后经下胚层移动到生殖新月区,最后,这些细胞进入血液循环,在生殖原基附近穿过毛细血管壁定居到生殖原基,在生殖原基分化成精子或者卵子[8].在此过程中数量从几十个增加到一千多个.

利用禽胚研究环境污染物的影响,一直以来的操作方法是直接将污染物注入到卵黄或者受精卵气室中.本研究利用禽PGCs迁移路线长(从起源到定居需100多小时),较哺乳动物易于操作的特点,分离发育至14期的鸡胚PGCs,用PKH26荧光染料进行标记后做为供体细胞,显微注射移植到用 PCB 52处理的受体鸡胚生殖新月中,然后检测血液和生殖原基中的外源 PGCs,研究PCB 52对PGCs迁移和增殖的影响.影响动物原始生殖细胞的发育及增殖的环境因素基本相似[9],所以研究环境污染物对禽类 PGCs发育的影响,对揭示一些鸟类尤其是濒危鸟类数量减少的原因有重要的参考意义.

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

白来航种鸡蛋购自中国农业大学养禽场.四氯联苯(PCB 52)和雌二醇(E2)购自美国Accustandard 公司,溶于二甲基亚砜(DMSO),配成 100mg/mL溶液,-20℃储存,使用时用最基础培养基(MEM)稀释.PKH26试剂盒购自Sigma公司,操作按照试剂盒说明书进行.白消安购于Sigma公司,使用时先用DMSO溶解,然后加入花生油充分乳化(油和 DMSO最终体积比为9:1).Nycodenz 购自Nycomed Pharma AS公司.

1.2 实验方法

1.2.1 供体鸡胚血液中 PGCs的采集[10]新鲜白来航鸡种蛋用 70%的酒精擦拭消毒后在38.5℃,相对湿度 70%,90°/h的转蛋条件下培养56h左右,使胚胎发育至14期左右,然后用微玻璃针由胚胎血管中抽取含有 PGCs的血液,悬浮于不含血清的 Dulbecco′s MEM(DMEM)培养液中.800×g离心5min弃上清液,加入10μL培养基.

1.2.2 供体鸡胚血液细胞PKH26标记 PKH26的标记参照试剂盒说明书进行,简要步骤如下:1)取细胞数1×107个/μL胚胎血细胞10μL,加试剂盒稀释液C 200μL,然后加5×10-6mol/L的PKH26 200μL,反复颠倒离心管染色3min;2)加400μL血清,置37℃ 1min使反应停止;3)加800μL含5%血清DMEM, 800×g离心5min,弃上清.重复洗涤3次,每次换新离心管;4)加1mL DMEM重悬.在荧光显微镜下确认细胞的标记率及荧光强度.

1.2.3 供体鸡胚 PGCs 的 PKH26标记后纯化 PGCs的纯化参照文献[11]的方法进行,简要步骤如下:将上述标记好的细胞 1200×g离心后弃上清,加1mL8% Nycodenz.在5mL离心管中底部加入 1mL12%Nycodenz,中部加 8%血液Nycodenz 混合液,上部加0.2mL 2% Nycodenz溶液.800×g 4℃离心 20min.收集 8%和 12% Nycodenz界面处的细胞各约0.3mL,置于离心管中.加1.4mL DMEM混匀,1200×g 4℃离心5min,重复洗涤 3次.弃上清液,加适量 DMEM,调整PGCs数为大约1000个/μL.

1.2.4 受体鸡胚内源性 PGCs的去除 用打孔器在种蛋气室打一小孔,然后用注射器由气室将白消安溶液注入卵黄.白消安使用浓度1.0µg/µL.每枚注射体积50µL.石蜡封口后38.5℃, 相对湿度70%, 90°/h的转蛋条件下孵化.

1.2.5 受体鸡胚的E2和PCB 52处理 将上述用白消安处理后的种蛋用牙钻打一直径大约5mm的窗孔,用微玻璃针将PCB 52或E2注入到靠近胚盘处,石蜡膜封闭窗口.E2剂量为每个鸡胚100μmol/L,PCB 52剂量为每个鸡胚10μmol/L,注射体积为每个鸡胚1μL.对照分为2组,一组鸡胚只注射E2或PCB 52等浓度的DMSO,一组不作任何处理(对照组受体均经过白消安处理).

1.2.6 PKH26标记的供体PGCs注射入处理组受体鸡生殖新月区域 将上述PCB 52或E2处理过的受体种蛋在 38.5℃,相对湿度 70%,90°/h的转蛋条件下培养至8～10期.然后用微注射法把上述标记PGCs 1μL导入受体胚盘生殖新月区域,密封后在相同条件下继续孵化至 13～15期和27～29期.对照组也注射相同数量的标记PGCs.

1.2.7 注射外源 PGCs后的受体胚胎继续孵化至13～15期时血液PGCs的采集和计数 待上述移植了标记PGCs的受体鸡胚孵化至13～15期时,用镊子小心打开蛋壳暴露胚胎,实体显微镜下以微玻璃针经背主动脉采血 1μL,加入培养液中混匀,800×g离心 5min,弃上清,加入 10μL培养基.取 5μL涂片,荧光显微镜下进行 PKH26标记PGCs的计数.PKH26标记细胞在绿光下呈红色荧光.

1.2.8 注射外源PGCs后的受体鸡胚继续孵化至5.5d时性腺PGCs的分离和计数 待上述移植了标记PGCs的受体鸡胚孵化至5.5d,此时鸡胚大部分发育至27期.将1对性腺置于含10%胎牛血清(FBS)的 DMEM(冰浴操作)中,然后置于含250μL 0.02% EDTA的PBS于37℃孵育,15min后用针头轻轻切割性腺.充分切割后的细胞悬液加入1.5mL含20%FBS 的DMEM 450×g离心5min.10μL DMEM重悬.混匀,取 5μL,涂片,荧光显微镜观察计数.

1.3 统计分析

统计分析软件采用 SPSS 11.5.资料在统计分析前均经SPSS的Explorer分析,数据均呈正态分布且方差相等.各组实验数据以均值±标准误表示,显著性水平设置为α＝0.05.

2 实验结果

2.1 PCB 52对外源PGCs数量影响

所有受体鸡胚注入 PKH26标记的外源PGCs,在外源PGCs沿生殖新月－血液循环－生殖原基迁移的过程中检测其数量变化.结果表明(表1),PCB 52处理组的PGCs数量明显低于未处理组及等量DMSO处理组,说明PCB 52可明显降低外源PGCs的增殖性迁移(P＜0.05).

表1 PCB52对PKH26标记外源PGCs数量的影响Table 1 Effect of PCB52 on proliferative migration of exogenous PGCs labeled PKH26

2.2 E2对外源PGCs数量的影响

为确定PCB 52对鸡胚的影响是否其雌激素作用,特设立E2处理组(表2),将PKH26标记的外源PGCs注入上述3组受体生殖新月,区域继续孵化,检测13～15期和27～29期的标记PGCs数量变化.结果表明,E2对外源PGCs的增殖性迁移无明显影响(P＞0.05).

表2 E2对PKH26标记外源PGCs数量的影响Table 2 Effect of E2 on proliferative migration of exogenous PGCs labeled PKH26

3 讨论

本实验中PCB 52的使用剂量采用PCB 52污染地区鸟类体内 PCB 52的浓度[12],以便在实验室条件条件下模拟自然界PCB 52的污染浓度.以往利用鸡胚研究污染物的影响时,通常将污染物注射到卵黄或者受精卵气室,本实验紧邻胚盘导入PCB 52,可使PCB 52立即对PGCs产生影响.因为鸡胚是典型的端黄卵,如果将外源物质注入到气室或者远离胚胎的其他位置,微量外源物质难以对迁移中的PGCs产生作用.

PCB 52被认为具有雌激素活性[7].在受PCBs污染地区,从食虫性鸟类(如大山雀)到食肉性猛禽(如埃及秃鹰)体内都可以检测到 PCB 52[12].尽管体内的PCB 52没有对成年鸟的健康造成明显损害,但对其所产卵有明显影响[12].实验证明,用PCBs处理未孵化鸡胚,对出壳后的鸡胚生殖系统可造成明显损害,影响其卵子和精子的形成[12-15].鸟类PGCs起源于胚胎外胚层,孵化过程中不同发育时期的PGCs均是在此基础上通过增殖性迁移而来.追踪不同发育时期的 PGCs数量,就可揭示环境污染物对PGCs的增殖性迁移影响[8].

本课题组以往的实验证明,PCB 52可明显降低原条期明区和血液中内源性PGCs的数量,并证明PCB 52对血液中PGCs的影响是由于降低了生殖新月明区PGCs的缘故[10].本实验通过显微移植技术,将供体鸡胚PGCs用PKH26荧光染料标记,然后移植到经PCB 52处理的受体鸡胚,随后检测发育至13～15期和27～29期时的PKH26标记的PGCs数量.结果表明,PCB 52可明显降低外源PGCs在血液和性腺中的数量,说明PCB 52对外源性 PGCs迁移有明显的阻碍作用.以往实验[16]和本实验结果表明,E2对内源性及外源性PGCs的增殖性迁移均无影响.E2对内源和外源PGCs的增殖性迁移无明显影响的机制是否与PGCs膜上的受体表达有关,或PGCs膜上受体表达的时空性等问题还有待于进一步探讨.E2对PGCs的迁移无明显影响,揭示PCB 52可能影响的是受体性腺的诱引物质,且这种影响是非雌激素作用.

由于内源性 PGCs的消除可明显提高外源性PGCs移植效率,所以在本实验中除了用PCB 52和E2处理受体鸡胚外,还用白消安进行了受体的处理.Song等[17]的研究表明,用白消安处理鸡胚盘,能明显降低内源性的PGCs数量,但对白消安处理鸡胚继续孵化20多个小时后注入的外源性PGCs的增殖性迁移无明显影响.

本实验所用的PKH26可有选择地嵌入细胞膜脂质层从而细胞被染色.PKH26从细胞溶出的半衰期是100d以上(体内),这种特性使得PKH26在生物体内的跟踪研究细胞时与其他标记物相比,具很大优势.在本实验中,通过PKH26的跟踪研究,发现PCB 52可明显降低外源PGCs的在血液循环中和生殖原基中的数量,这表明 PCB 52在鸡胚体内的半衰期很长,对细胞的毒性影响最少持续100多小时,对胚胎的原始生殖细胞可造成长久的有害影响.

4 结论

4.1 本实验表明, PCB 52对外源性PGCs的增殖性迁移有明显影响.

4.2 E2对外源性PGCs的增殖性迁移无明显影响.

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