转基因动物技术的主要应用

赵胤泽 汪琳 柏亚铎 邢佑尚

(1.北京出入境检验检疫局 北京 100026;2.沈阳农业大学)

1 前言

转基因动物技术是人类按照自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成,是基于现代分子生物学、动物胚胎学和配子生物工程技术的一项综合技术。尽管对转基因动物的实际应用还有许多关键性的技术问题需要解决,但转基因动物在生物基础研究、医学、农业、环境保护等领域已显示了广阔的应用前景。随着基因工程的不断发展,转基因动物技术将不断得到完善,可以广泛运用到未来的生产和生活中。

2 利用转基因动物建立人类疾病和药物筛选模型

转基因动物作为疾病模型可以替代传统的动物模型进行病理治疗研究和新药筛选。一般认为,除外伤外,几乎所有疾病都有一定程度的遗传因素参与,研究遗传与疾病的关系有非常重要的意义。利用转基因动物技术可以建立敏感动物品系及产生与人类疾病相同的疾病动物模型,可以阐明遗传改变所产生的效应,确定致病基因的功能和致病机理,以便进行科学的诊治。这种动物模型用于新药筛选准确、经济、试验次数少,现已成为人们进行“快速筛选”的一种手段,目前已有不少成功的例子。如将功能缺陷的基因导入小鼠生殖细胞中,制备得到遗传性疾病的转基因动物模型;将βs-珠蛋白基因和人α-珠蛋白基因在 LCR控制下转入小鼠制得了镰刀状细胞贫血小鼠模型,丰富了对人镰刀状细胞贫血的认识和病程的了解,并且可以用于研究药物作用及作用的部位,也可用于基因治疗的研究。

在糖尿病的治疗研究中,人们发现功能性胰岛β细胞的数量决定了糖尿病的发生、发展和预后[1～2]。斑马鱼具有体外受精、胚胎期透明、高产和体积小等诸多生物学研究的优势,夏铭等[3]运用转基因技术,将胰岛斑马鱼基因组,以可视化的荧光蛋白素基因特异性启动子驱动荧光蛋白的表达构件导入来示踪胰岛β细胞发育的情况,以研究胰岛β细胞发育、分化等相关作用。由于胰岛β细胞是体内唯一表达胰岛素的器官,所以当胰岛素开始表达时,荧光蛋白共表达于胰岛β细胞,通过先进的体内摄像系统,跟踪它们的起源、发育和分化等相关作用,实现对细胞结构的标记[4];同时今后可以利用这些细胞的分子标记分离这群细胞,成为分析基因表达和基因功能的重要工具[5],运用原位杂交技术,可以实现对内源性胰岛素基因的探测。目前斑马鱼已经成为最先进的脊椎动物模型,其胚胎期透明的优势与荧光素报告基因结合的转基因系统的建立,可以在活体通过示踪荧光蛋白标记的胰岛β细胞,研究胰岛β细胞发育,并提供了一个进行胰岛β细胞损伤和再生研究的新型遗传学动物模型。

3 利用转基因动物研究基因的功能和作用

在研究基因功能方面,人们大量使用了转基因动物技术。在此仅叙述几例。

(1)Dkks基因是近几年发现的编码分泌性Wnt拮抗剂的一个小家族,家族成员 Dkk3与同族其它成员性质差别较大。所有的 Dkks于调节上皮间质转化的组织中有明显的表达增加[6],其可能于间质和上皮细胞中发挥诱导性相互作用,表明它们可能参与心脏、牙齿、头发和胡须囊泡以及肢体和骨的诱导作用。尽管有关 Dkk家族的研究报道较多,但对Dkk3的研究较少,其生物学作用仍有大量未知数[7]。利用生物信息学分析软骨内骨的形成模型时,发现Dkk3是众多表达上调基因之一,表明Dkk3对骨形成可能具有重要的调节作用。

吕丹等[8]建立系统性表达 Dkk3转基因小鼠,以对其生理功能特别是对骨发育的作用进行深入研究提供模型动物,通过 ISH来观察 Dkk3于C57BLP6J小鼠全身组织中的表达。把 Dkk3基因插入系统性表达 CMV启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立 C57BLP6J Dkk3转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测Dkk3在骨髓中的表达,Western Blot检测 Dkk3在肺脏、脑及肝脏中的表达,BrdU标记染色观察转基因小鼠骨生长情况。结果显示在生理状态下,Dkk3基因广泛表达,在骨、心脏及脑等组织高表达。研究发现 Dkk3可能对成骨作用具有抑制作用,但是对软骨形成无作用,表明 Dkk3在软骨内骨形成中具有重要的调节作用,此转基因小鼠为 Dkk3对骨生长发育的作用研究提供了有价值的工具动物。

(2)WIF-1(Wnt inhibitory factor-1)是 wntPβ-catenin信号通路属于 sFRP一类的拮抗物之一,其作用方式是通过与Wnt蛋白直接结合阻止了Wnt与受体蛋白复合物的结合,使细胞质中的β-catenin由于磷酸化而不能积累,从而阻断了 WntPβcatenin经典通路和非经典通路[9]。周文君等[10]建立心脏特异表达 W IF-1转基因小鼠,研究该基因在心脏中表达对小鼠心脏发育、形态和功能维持中的作用。通过 RT-PCR法克隆人W IF-1基因,把W IF-1基因插入α-MHC启动子下游,插入 PMD-18T载体构建转基因表达载体,通过显微注射法建立转 WIF-1 C57BLP6J小鼠。利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因表型,RT-PCR和Western blot检测基因表达水平,超声检测不同月龄W IF-1转基因小鼠心脏结构及功能变化。心脏超声检查证实,W IF-1转基因小鼠与对照小鼠比较,左心室重量减小,舒张期左室内径和容积变小,每搏输出量和心输出量减小,证明W IF-1基因是心脏功能的负调控因子。

转基因动物技术还广泛地应用于研究调控基因与结构基因之间的关系、顺式调控区元件对结构基因表达的影响、结构基因的组成对表达的影响和基因表达的时间空间顺序等方面。人们很早就知道基因表达的时空顺序是由某些激素类信号、邻近组织产生的诱导物等因素调节,但是,只有转基因动物出现之后,人们才能真正比较方便地证实高等动物基因表达的时间空间顺序的调控机制。

4 转基因动物在病毒研究方面的应用

病毒一般均存在嗜亲性,因为在敏感细胞表面上有能与病毒结合的受体,这是病毒建立感染的先决条件。但许多人类致病病毒只感染人和灵长类动物,给研究带来很大困难。将人的病毒受体在小鼠体内表达,使只能感染人的病毒能感染小鼠,这样就为人类研究病毒的致病性和防治方法提供了方便有用的动物模型。

正常情况下 EB病毒不能感染正常小鼠的淋巴细胞,Kearns等通过显微注射法将 EB病毒的受体基因 CR2注射至受精卵中产生转基因小鼠,在可以表达 CR2基因 mRNA的鼠系中,流式细胞仪及免疫沉淀分析显示:15%～30%的胸腺脾淋巴结细胞的表面表达 CR2基因并可结合 EB病毒,不过只有1%的细胞中有病毒进入并复制,且 EBV的感染不使这些细胞死亡,提示 CR2基因的表达并非建立感染的唯一条件。彭银祥等[11]还指出转基因动物在研究肿瘤病毒方面也得到广泛应用。

人肝炎病毒不能感染非灵长类动物,要研究肝炎病毒的致病机理、药物疗效等必须使用动物模型。自 1985年 Chisari等首先建立 HbsAg大蛋白的HBV转基因小鼠 (transgenic mice,Tg)模型以来,这类模型已成为人们研究 HBV分子生物学、免疫学及病毒性肝炎病理发生的重要动物模型[12]。国内学者胡卫江等[13]构建了含有 HBV全基因组的 ayw型和 adr亚型的 Tg鼠,为研究分布在不同地域的 HBV亚型的分子生物学特性的差异及感染后不同表现提供了理想的动物模型。第二军医大学基础医学部细胞生物学实验室多年来相继构建了 HBV ayw亚型、adr亚型的全基因组 Tg鼠和 HBV presS/S、HBV x adr亚型的 Tg鼠[14],已建立的乙肝 Tg鼠C572TgN(HBVadr2.0)S MMU品系,经研究具有如下特征:HBV基因在转基因小鼠基因组中整合并能稳定遗传;血清中存在 HBsAg和 (或)HBeAg;肝组织有 HBsAg、HBcAg、HBxAg表达;血清中存在 HBV DNA;肝组织中有病毒样颗粒。

5 利用转基因技术改良动物品种和生产性能

(1)转基因技术可用于动物抗病育种。通过克隆特定病毒基因组中的某些编码片段,并进行一定程度的修饰后转入动物基因组中,如果转基因在该动物基因组中得以表达,那么,该动物对这种病毒的感染应具有一定的抵抗能力,或者应能减轻该种病毒侵染时给动物机体带来的危害。例如 Clements等将绵羊髓鞘脱落病毒的表壳蛋白基因转入绵羊,获得的转基因动物抗病力明显提高。2004年,日美联手利用基因工程手段培育出对疯牛病 (牛海绵状脑病,BSE)具有免疫力的牛[15],这种转基因牛不携带普里昂蛋白或其他传染性蛋白。2005年,Donovan等[16]将编码溶葡球菌酶的基因转入奶牛基因组中获得转基因牛,证明在其乳腺中表达的溶葡球菌酶可以有效预防由葡萄球菌引起的乳房炎。

(2)饱和脂肪酸摄入过多会引起高脂血症,而不饱和脂肪酸对健康有益。2006年 4月,美国密苏里 -哥伦比亚大学的赖良学等[17]获得了转线虫 fat-1基因 (ω-3去饱和酶基因)的体细胞克隆猪,在其体内表达的转基因可以将猪体内的ω-6系饱和脂肪酸转化为ω-3系不饱和脂肪酸,提高了ω-3系脂肪酸含量,降低了ω-6/ω-3的比例,大大提升了猪肉的营养价值。

6 利用转基因动物生产人用器官移植的异体供体

由于供体器官严重匮乏,人们不得不重视异种移植的研究,而研究人员普遍认为猪是人类器官移植的最理想供体。因为猪的器官大小及解剖生理特点与人类相似,与其它动物相比,猪的组织相容性抗原和人类白细胞抗原具有较高的同源性,携带人兽共患病病原体相对较少,容易饲养,饲料费用低廉,且妊娠期短,产仔数多,不存在伦理方面的问题。然而,超急性排斥反应 (Hyperacute rejection,HAR)却阻碍了异种移植的临床应用。为解决这一问题,研究人员将抑制排斥反应的 DAF(Decay accelerating facter)基因,RAC(Regulators of complement activation)基因和 MCP(Membrane-cofactor protein)基因导入猪基因组,试图把表达人补体调节因子的转基因猪的组织和器官移植到人体。2007年,Imutran公司进行了一次转 hDNF基因猪的肾脏与心脏移植给猕猴和狒狒的实验,观察到 HAR的出现率为 6%-11%,对照组 HAR的出现率为 20%-57%,公司认为使用转 HDAF基因猪的实体器官移植到灵长类能部分抑制 HAR[11]。

当把猪的器官移植给人体以后,人体中的天然抗体将迅速结合到猪器官的血管内壁上,从而激活补体系统,使猪的器官在数分钟内坏死。造成这种现象的原因是猪细胞表面的一个通过α(1-3)连接的半乳糖表位,人体中约有 1%的免疫球蛋白认识这个抗原表位并发生交叉反应。因此,阻断这种HAR的直接方法是把猪基因中的α-1,3-半乳糖苷转移酶基因剔除,这样,猪细胞就不能表达这个抗原表位,最大限度地减少 HAR。如果同时表达可缓解补体系统的其他基因,猪的器官就真能成为人体器官移植代用品的来源。2002年,Lai等和 Dai等结合基因打靶和体细胞核移植技术,采用敲除α-1,3半乳糖苷转移酶基因(GGTA1)的胎儿成纤维细胞作核供体,成功地获得了α-1,3半乳糖苷转移酶基因敲除的猪。这一研究结果将为人类利用异种器官清除一大障碍,为生产可供人类移植用的异种器官开辟一条途径。

7 利用转基因动物生产人药用蛋白和营养保健蛋白

用转基因动物生产重组蛋白 (生物反应器)可能是转基因动物的最大应用。目前,把转基因动物当作生物反应器来生产药用蛋白已经受到国际社会的极大关注,不仅各国政府,一些私人集团也不惜投入大量资金加以研究和开发。由于许多治疗性蛋白产品结构复杂、修饰要求高,只能使用哺乳动物细胞生产,而用动物细胞生产成本高,难以满足需求,用动物作为生物反应器正好满足了这些要求。

动物乳腺生物反应器与其他表达系统相比有许多独特优势,首先,用它生产的外源蛋白具有体外哺乳动物细胞生产外源蛋白的所有特点。其次,乳汁的量大、价格低廉,乳腺还有良好的渗透屏障,能有效地抑制目的蛋白返回动物血中,不影响动物的生理活动。乳腺生物反应器与传统的细菌和细胞发酵系统相比,几乎克服了后两者的所有缺点而兼具两者的所有优点。

乳腺生物反应器作为一种全新生产模式,在生产高附加值蛋白方面展现出广阔的应用前景。2004年,Reh等[18]将大鼠硬脂酰辅酶 A的基因转入羊体内,获得的转基因羊乳汁中单不饱和脂肪酸和共轭亚油酸含量明显提高,对心血管病人的健康非常有益。2006年,美国科学家Maga等[19]培育出乳汁中分泌有人溶菌酶的转基因山羊,奶样的饲喂实验表明,转基因奶显著降低了仔猪胃肠道的大肠杆菌等细菌数量,从而证明该转有人溶菌酶基因的山羊奶可以用于预防婴幼儿腹泻等疾病,2009年在美国上市。

截至目前,全世界从事乳腺生物反应器商业化开发的公司已有 10多家,表达水平可以进行商业生产的药物有近 40种[20],见表 1。

表 1 目前部分已投放市场或正在开发的生物技术药物

8 结语

转基因动物研究自问世以来,经过世界各国科学家们的不懈努力,已经取得了辉煌的成就。转基因动物带来的不仅仅是一种全新的药物生产模式,而且还为人类社会带来了新的经济增长点。据美国红十字会和遗传学会预测:到 2010年,动物乳腺反应器生产的药物将占所有基因工程药物的 95%,成为具有高额利润的新型产业。

作为一个新生产业,转基因动物的发展过程可能存在着一定的问题,但无可否认,转基因动物具有独特的优势,随着理论和技术的不断完善,转基因动物及其相关产品必将进入真正的产业化和市场化阶段,对人类的生产和发展起着推动性的作用。

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