山楂提取物的抗氧化活性研究

黄优生, 谢明勇, 聂少平, 李昌

(1.食品科学与技术国家重点实验室,南昌大学,江西南昌 330047;2.江西省分析测试研究所,江西南昌 330029)

山楂提取物的抗氧化活性研究

黄优生1,2, 谢明勇＊1, 聂少平1, 李昌1

(1.食品科学与技术国家重点实验室,南昌大学,江西南昌 330047;2.江西省分析测试研究所,江西南昌 330029)

采用不同提取方法提取山楂活性成分,分别用DPPH法、邻苯三酚自氧化法测定了不同提取物的抗氧化作用。结果表明,不同提取物均有抗氧化活性,提取物量与抗氧化活性呈正相关,不同提取物抗氧化活性强弱为:醇提物>超临界CO2提取物>水提物。山楂提取物中乙酸乙酯萃取部分抗氧化活性最强。

山楂;抗氧化;DPPH;邻苯三酚自氧化

自由基是指带有未成对电子的分子、原子或离子,其中与人体关系最为密切的是氧自由基,如超氧自由基(O2-·)、羟基自由基(·OH)、脂自由基(ROO·)等,其中以O2-·形成最早,·OH作用最强[1]。衰老、癌症及炎症等疾病与体内脂质过氧化和自由基有直接关系。因此,有关抗氧化剂清除自由基的研究得到普遍关注。抗氧化剂分为合成抗氧化剂和天然抗氧化剂,目前,广泛使用的合成抗氧化剂主要有BH T(2,6-二叔丁基对甲酚)、BHA(叔丁基-4-羟基茴香醚)和 TBHQ(2,4,5-三羟基苯基丁酮)等,然而,动物实验表明它们有一定的毒性[2-3],因此天然抗氧化剂取代合成类抗氧化剂是一种必然的趋势,近年来,从天然动植物,尤其是从具有悠久历史的中草药中寻找高效的自由基清除剂,引起国内外学者的极大兴趣[4-5]。

现代药理研究表明,山楂具有抗动脉粥样硬化,降低血压,抗癌、防癌等作用[6-7]。也有研究表明,山楂具有抗氧化作用,如赵二芳等[8]比较了山楂提取物、VC和槲皮素的抗氧化能力,结果表明,山楂提取物具有较强的抗氧化能力,抗氧化能力VC>槲皮素>山楂提取物。回瑞华等[9]用流动注射化学发光法测定了山楂果的抗氧化性能,发现山楂果具有较强的抗氧化性能,并且抗氧化性能随着浓度的增加而增加。

本文采用不同提取方法提取山楂活性成分,分别用DPPH法、邻苯三酚自氧化法测定了不同提取物的抗氧化作用,并与合成抗氧化剂BH T和抗坏血酸清除自由基能力进行比较,以此来评价其抗氧化能力,对于寻找新型高效的抗氧化剂及进一步开发利用山楂资源有一定意义。

1 材料与仪器

1.1 材料和试剂

山楂:山东莱芜产大金星品种;二苯基苦味酰基苯肼(DPPH);邻苯三酚;BH T乙醇溶液:Tris-HCl缓冲液;抗坏血酸、BHT均为食品级;其它试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器和设备

TU-1900双光束紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限公司产品,Spe-ed SFE-2超临界萃取仪:App lied separation,Inc.产品;FA 1104电子天平:上海精天电子仪器厂产品;电子恒温不锈钢水浴锅:上海宏兴机械仪器实业制造公司产品;旋转蒸发仪:上海申生科技有限公司产品;DGG-9140B电热恒温鼓风干燥箱:上海森信实验仪器有限公司产品。

2 实验方法

2.1 不同提取方法提取山楂活性成分

2.1.1 乙醇回流提取法 准确称取干燥山楂20.00 g,于70℃按固液比1∶20加入体积分数70%乙醇回流提取 2 h,重复1次,合并提取液,滤液真空浓缩至浸膏,40℃真空干燥,称重,体积分数95%乙醇溶解,定容至一定浓度,备用。

2.1.2 超临界CO2萃取法 选取100 m L萃取釜,准确称取干燥山楂20.00 g,放入萃取釜,于36.6 Mpa、47.8℃下萃取4次,每次按1∶1加入体积分数95%乙醇作为夹带剂萃取30 min,收集萃取液,真空干燥,称重,体积分数95%乙醇溶解,定容至一定浓度,备用。

2.1.3 水提取法 准确称取干燥山楂20.00 g,按固液比1∶20加水提取2 h,重复1次,合并提取液,滤液真空浓缩至浸膏,40℃真空干燥,称重,水溶解,定容至一定浓度,备用。

2.1.4 不同极性部分的制备 称取干燥山楂适量,按2.1.1和2.1.2方法提取,提取液经真空浓缩至小体积,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,得到乙酸乙脂、正丁醇和萃余层三部分,各部分浓缩、干燥、称重,定容至一定浓度,备用。

2.2 山楂活性成分的抗氧化活性试验

2.2.1 山楂提取物对DPPH·自由基的清除作用试验 将1 m L不同浓度的样品溶液加入2 mL 0.1 m g/m L DPPH溶液中,用溶剂定容至5 m L,迅速混匀,30 min后于517 nm下测定其吸光度A。根据下列公式计算清除率[10]:

A0为未加样的DPPH吸光度;A为样品与DPPH反应后的吸光度;A2为样品的空白的吸光度。

2.2.2 半清除率的测定 半清除率指清除率为50%时所需样品的浓度,根据不同浓度样品对有机自由基DPPH的清除率作曲线求出。所需浓度越低,表明半清除率越高。

2.2.3 山楂提取物抑制邻苯三酚自氧化作用试验

在10 mL容量瓶中加入5 m L Tris-HCl缓冲液,一定量的待测液或BH T溶液,于25℃恒温水浴中放置20 min后,加入0.1 m L的25℃预热的邻苯三酚溶液,迅速混匀,在5 min内,每隔30 s于420 nm处测定溶液的吸光度(以 Tris-HCl缓冲液为空白对照)。计算吸光度随时间的变化率,并与空白溶液比较,便可得出被测物抑制 O2-·作用的能力[11-12]。清除率计算式:

式中,F0和Fx分别表示空白溶液和被测液的吸光度随时间的变化率。

3 结果与讨论

3.1 山楂提取物对DPPH·自由基的清除作用

对自由基的清除能力以清除率表示,清除率越高,提取物抗氧化能力越强。按2.2.1方法测定了不同提取方法所得山楂提取物、VC及BHT对DPPH·自由基的清除能力,结果如图1所示。

图1 不同提取方法所得山楂提取物对DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect on DPPH radicals of hawthorn extracts origin from different process

从图1可以看出,3种不同提取方法所得山楂提取物都具有一定的清除自由基活性的能力,且随着提取物浓度增加,清除率逐渐升高,当浓度增加到一定值后,清除率趋于平缓。在一定浓度范围内,醇提取物的抗氧化能力最强,超临界CO2提取物次之,水提物的清除能力最弱。其原因可能是由于不同提取方法所得粗提物成分不同,所提取的抗氧化物质的总量和种类也不同,而且其中各物质的协同作用也不一致,导致了不同提取方法所得山楂提取物的抗氧化能力不同。对于DPPH·自由基的清除率,当山楂醇提物和SFE提取物浓度达到2 mg/m L时已超过4 mg/m L BH T的抗氧化效果,相当于0.5 mg/m L的抗坏血酸的抗氧化效果,表明山楂醇提物和SFE提取物均具有较强的抗氧化能力。

半清除率浓度是自由基清除率在50%时的浓度,以 EC50表示,常用来比较清除DPPH自由基的能力大小(图2)。图2从图中可见,对自由基清除能力以醇提物最强(EC50=0.39 mg/mL),超临界CO2提取物略低,水提物最弱。

图2 不同山楂提取物的EC50比较Fig.2 Comparison of EC50 of hawthorn extracts origin from different process

3.2 不同极性部分对DPPH·自由基的清除作用

按2.1.4方法将回流提取和超临界CO2提取物分成极性不同的3个部分:乙酸乙酯萃取部分、正丁醇萃取部分及萃余物部分,各部分按方法2.2.1测定,结果见图3、图4。

由图3、4可知,在乙酸乙酯、正丁醇和萃余物三个萃取部分中,乙酸乙酯萃取部分清除DPPH·自由基能力最强。该极性部分含有黄酮类化合物、绿原酸和原花青素等[13],这类化合物具有较强的清除自由基和抗氧化活性,因此,山楂提取物中乙酸乙酯萃取部分抗氧化活性最强。

图3 醇提物各萃取部分清除DPPH自由基的作用Fig.3 Scavenging effect of ethanol extracts fractions on DPPH radicals

图4 超临界CO2提取物各萃取部分清除DPPH自由基的作用Fig.4 Scavenging effect of different fractions of SFECO2 extracts on DPPH radicals

3.3 山楂提取物抑制邻苯三酚自氧化的作用

邻苯三酚(PR)在碱性条件下会发生自氧化,生成有色中间产物和超氧阴离子自由基(O2-·),O2-·自由基对自氧化有催化作用,提取物对邻苯三酚自氧化的抑制率可作为它对O2-·自由基的清除率的表征,据自氧化速率变化来计算提取物对O2-·自由基的清除率。

由图5可知,提取物能明显降低邻苯三酚自氧化的速率,随着提取物浓度增加,抑制率逐渐增高,但当浓度增加到一定值后,抑制率呈平缓趋势。

图5 不同山楂提取物抑制PR自氧化的作用Fig.5 Inhibition for PR of different hawthorn extracts

如图5所示,不同提取方法提取物对O2-·自由基的清除能力不同,醇提物和SFE提取物对O2-·自由基的清除能力与BHT相当,其中醇提物略高于超临界CO2提取物,水提物较低。由此可见,山楂醇提物和超临界CO2提取物对O2-·自由基也有较强的清除能力。

4 结 语

综上所述,山楂不同提取物抗氧化能力不同,醇提物最高,超临界CO2提取物次之,水提物较低。其原因可能是由于不同提取物成分不同,所提取的抗氧化物质的总量和种类也不同,而且其中各物质的协同作用也不一致,导致了不同方法提取的山楂提取物的抗氧化能力不同。其机理还有待进一步深入研究,这也是今后研究的目标。

山楂具有药食两用的特点,将山楂提取物添加至食品中即可以增加食品的营养成分,又可起到抗氧化的功效,从这一点可以看到山楂产品的开发具有广阔的应用前景。

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Anti-Oxidative Activity of Extracts from Hawthorn

HUANG You-sheng1,2, XIE Ming-yong＊1, NIE Shao-ping1, L IChang1
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Analytical and Testing Research Institute of Jiangxi Province,Nanchang 330029,China)

The anti-oxidative effect of haw thorn extracts origin from different process were study by using DPPH and pyrogallol autooxidation methods in this manuscript.The results show ed that all of them had anti-oxidative activity,and exhibit a positive correlation with the concentration and the anti-oxidative activity of the extracts.Among of them,the order of antioxidative effect was listed as follow s:obtained from ethanol bath>SFE-CO2>water.The ethyl acetate part of haw thorn extracts demonstrated the strongest anti-oxidative activity.

haw thorn,antioxidation,DPPH,pyrogallol autooxidation

R 284.2

A

1673-1689(2010)02-0189-04

2009-04-13

基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0540)。

＊

谢明勇(1957-),男,江西宜春人,博士,教授,博士生导师,主要从事天然产物研究与开发。Email:myxie@ncu.edu.cn

(责任编辑:杨萌)