柑橘黄酮对内毒素诱发大鼠乳腺炎的抑制作用*

徐晓虹， 陆 蓓,2， 阮 琴

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004;2.金华市药品检验所，浙江 金华 321000)

柑橘为芸香科柑橘属植物，其干燥果皮可用作中药材陈皮，有理气健脾、燥湿化痰的功效，是我国常用中药资源之一.药理学研究表明黄酮是柑橘皮中的有效活性成分，具有抗炎[1]、抗氧化[2-3]、抗过敏[4]及降低血液和肝脏中胆固醇的作用[5].柑橘黄酮(citrus flavonoids，Cf)的主要成分之一橙皮苷(hesperidin)属二氢黄酮苷化合物，是制备二氢黄酮类和二氢查尔酮等药物的原料，具有防治心脑血管疾病和支气管炎的作用.此外，早在《本草纲目》中就有陈皮甘草汤治疗乳痈的记载.乳痈即现代医学的急性乳腺炎，其成因与肝气郁结、胃热壅滞有关.大剂量的陈皮可理气开瘀，结合辨证加味，对未成脓的急性乳腺炎初期有很好的防止化脓、消退痈肿作用.但目前国内外有关柑橘黄酮抗乳腺炎的研究未见报道.

乳腺炎是奶牛养殖中最常见且治疗费用高的一种疾病，给奶牛业带来极大的损失.长期以来，国内外主要应用抗生素和抗菌药物治疗奶牛乳腺炎，虽然效果较好，但可导致动物的抗药性，并造成抗生素在牛奶中残留，长期饮用有害人体健康.柑橘的世界年产量居水果首位，我国柑橘产量居世界第一，每年大量加工和消费柑橘的同时也产生数量惊人的柑橘果皮(约占果质量的20%～25%).如果柑橘黄酮具有抑制乳腺炎的作用，那么，既可以利用柑橘果皮提取其有效成分用于临床防治乳腺炎，又可开发奶牛饲料添加剂用以防治奶牛乳腺炎的发生.为此,本实验用大肠杆菌内毒素诱发大鼠乳腺炎模型，研究了柑橘黄酮抗乳腺炎的作用，并进一步测定了其对乳腺炎主要病原菌的体外抑菌活性.

1 材料与方法

1.1 主要试剂及药品

柑橘黄酮(Cf)由金华贝康公司提供，含橙皮苷5.72%，总黄酮12.30%;内毒素(endotoxin)即脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，由O55：B5血清型大肠杆菌(Escherichiacoli)分离提纯(购自美国Sigma公司);加拿大树胶(20010621)从加拿大进口;其余试剂均为国产分析纯.与BECKMAN LX20全自动生化测定仪(美国贝克曼库尔特公司)相配套的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)测定试剂盒.

1.2 菌种及培养基

大肠埃希菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusauerus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)均由中国药品生物制品检定所提供.所用培养基均为干燥培养基，由北京三药科技开发公司提供.

1.3 动物分组及处理

SD大鼠，雌性24只，体质量250～280 g；雄性12只，体质量300～350 g，从浙江省实验动物中心购入，合格证号SCXK(浙)2003-0001.适应性饲养1星期后，将雌鼠与雄鼠按2∶1比例合笼饲养，使之交配受孕.次日08:00时检查阴栓并对雌性大鼠阴道进行涂片检查精子，凡查到精子的定为妊娠第0天.将妊娠大鼠随机分为4组，自确认妊娠当日开始灌胃给药,正常对照组(n=6)和模型组(n=6)给予生理盐水，高、低2个剂量实验组(H-Cf,n=6;L-Cf,n=6)分别给予600和200 mg·kg-1·d-1柑橘黄酮.给药时间自妊娠第1天直至处死(产后4 d).模型组及实验组分别于产后72 h经乳头管注入内毒素0.01 mL(10 μg),正常对照组于产后72 h经乳头管注入灭菌生理盐水0.01 mL.

1.4 乳腺炎模型的建立

按文献[6]的方法经乳头管灌注大肠杆菌内毒素诱发大鼠急性乳腺炎动物模型.乳腺内灌注前24 h将母鼠与仔鼠分离.母鼠在产后72 h经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用75%乙醇溶液对第4对乳腺区域(腹部乳区)进行消毒，然后用小镊子轻轻夹起乳头，用20 μL的微量注射器轻轻刺破皮肤沿乳头管插入，注入10 μg(0.01 mL)内毒素.灌注后24 h，将母鼠颈静脉放血处死.

1.5 血清碱性磷酸酶(AKP)的含量测定

放血处死母鼠时收集颈静脉血，室温放置20 min后，3 000 r/min离心15 min分离血清，用AKP试剂盒测定AKP水平.

1.6 乳腺病理学观测

母鼠颈静脉放血处死后，打开腹腔，观察乳腺的病理变化.分离第4对乳腺，取适量乳腺组织用10%甲醛溶液固定，制备石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色处理后用于病理学检查.

1.7 最低抑菌浓度(MIC)测定

为了进一步分析对柑橘黄酮敏感的主要乳腺炎致病菌，采用试管稀释法(二倍稀释法)测定柑橘黄酮对3种乳腺病原菌的最低抑菌浓度[7].取37 ℃培养18～24 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌菌株的营养肉汤培养物，用9 g/L灭菌生理盐水进行10倍系列稀释，使最终菌液浓度为1×103～1×105cfu·mL-1.柑橘黄酮用灭菌生理盐水溶解后制成0.1 g·mL-1的母液，采用集菌仪与一次性薄膜过滤器除菌.用试管稀释法测定MIC时，每种菌液分5管分别加入含0.05,0.025,0.012 5和0.006 g·mL-1柑橘黄酮和灭菌生理盐水(空白对照)的培养液，每一浓度重复3管.细菌经37 ℃培养48 h，真菌经25 ℃培养72 h后，分别观察结果，得出柑橘黄酮对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度.

1.8 数据统计方法

2 结 果

2.1 乳腺病理变化的组织学检查

乳腺内灌注内毒素24 h后，各组母鼠均无死亡.从图1病理切片结果可见:灌注灭菌生理盐水的对照组大鼠乳腺组织无异常病理变化(见图1中A和B)；乳腺内灌注内毒素24 h后，大鼠乳腺组织结构崩塌，腺体内有大量密集炎性细胞浸润，其中以嗜中性粒细胞为主(见图1中C和D);低剂量柑橘黄酮预处理的母鼠乳腺灌注内毒素24 h后乳腺组织结构不清，但仍可辨认，腺泡腔内出现炎性细胞浸润，以嗜中性粒细胞为主(未显示病理图片);高剂量柑橘黄酮预处理的母鼠灌注内毒素24 h后乳腺组织结构清楚，腺泡腔内空泡数量增加，只有少量的炎性细胞浸润(见图1中E和F).

对照组乳腺组织:A(×100),B(×400);模型组乳腺组织:C(×100),D(×400);600 mg·kg-1·d-1柑橘黄酮组乳腺组织:E(×100),F(×400)

2.2 血清碱性磷酸酶(AKP)含量测定

与对照组相比，模型组的AKP含量明显升高(P<0.01)；而高剂量柑橘黄酮组母鼠的AKP水平极显著低于模型组(P<0.01)，低剂量柑橘黄酮组的AKP水平与模型组相近，并明显高于对照组(P<0.01,见表1).

2.3 最低抑菌浓度(MIC)测定

柑橘黄酮对3种乳腺病原菌均有抑制作用，但不同菌种对柑橘黄酮的敏感性不同.柑橘黄酮对金黄色葡萄球菌的MIC为0.012 5 g·mL-1，对大肠埃希氏菌及铜绿假单胞菌的MIC为0.025 g·mL-1(见表2).

表1 柑橘黄酮对母鼠血清中碱性磷酸酶含量的影响

表2 柑橘黄酮水溶液的抑菌作用

3 讨 论

本实验采用从乳头管注入内毒素诱导分娩3 d的母鼠发生乳腺炎.大肠杆菌内毒素是革兰氏阴性菌外膜的重要组成成分，是介导系统性炎症反应综合症的主要启动因子.内毒素本身并不造成机体的严重损害，它主要促使巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞等释放大量的细胞因子TNF,PLA2,PKC,IL-6,前列腺素和氧自由基等，这些因子通过自分泌、旁分泌相互联系、相互影响，使病变得以发展[8].嗜中性粒细胞是乳腺炎症早期的主要浸润细胞，而在健康乳腺中嗜中性粒细胞的数量很低(<105/mL).发生乳腺炎时，嗜中性粒细胞在炎性介质的诱导下从血液向乳腺游走，其数量可占整个乳腺白细胞的90%以上(>106/mL)[9].从本实验的病理切片可见,乳腺炎模型的乳腺泡腔内出现大量以嗜中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，与文献报道的乳腺炎病理变化相一致，说明内毒素诱发大鼠乳腺炎模型成立.

母鼠妊娠后每天给予柑橘黄酮可以有效减轻内毒素诱导的乳腺炎的发生，特别是高剂量(600 mg·kg-1·d-1)的柑橘黄酮具有明显的抑制乳腺炎症反应的作用.有报道:柑橘黄酮类化合物中的橙皮苷是一种有效的抗过敏成分，能显著抑制小鼠的巨噬细胞释放组胺；橙皮苷和洋芫荽苷可抑制脂氧合酶、环氧化酶和磷酸脂酶A2，从而显著抑制膜溶酶体和花生四烯酸的释放；而花生四烯酸释放的抑制又促使脂氧合酶、环氧化酶的底物缺乏，进一步抑制在炎症中起关键作用的组胺的释放，从而起到抗炎和抗过敏作用[10].同时，柑橘黄酮还可影响与炎症相关的淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞、中性粒细胞的分泌、移动,促进有丝分裂等活动[11-12].因此，柑橘黄酮预防大肠杆菌内毒素诱导的乳腺炎发生可能与其抑制乳腺细胞的炎症反应有关.

碱性磷酸酶在生理性pH环境下能有效地将内毒素(脂多糖)的类脂A去磷酸化，削减脂多糖的生物活性，抑制内毒素诱发炎性细胞因子的产生,从而达到解毒作用，并阻止内毒素性休克的发生与发展[13].本实验发现乳腺炎模型大鼠血清的碱性磷酸酶活性比对照组显著升高.这可能与内毒素灌注后诱发体内碱性磷酸酶的激活，以削弱内毒素的生物活性，减少其诱导炎性细胞因子的产生有关.这就不难解释高剂量柑橘黄酮组大鼠的血清碱性磷酸酶水平明显低于乳腺炎模型组的现象：在内毒素诱导乳腺发炎的初始阶段,柑橘黄酮就抑制了组胺及炎性细胞因子的释放，减轻炎性反应，因而体内诱发的碱性磷酸酶减少.

乳腺炎的发病原因有多种，但主要由病原微生物引起.而诱发乳腺炎的病原菌主要有金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌，奶牛的乳腺炎还可由无乳链球菌和停乳链球菌等引起[14].真菌性乳腺炎主要由念珠菌属、隐球菌属、毛孢子菌属和曲霉菌属等引起, 但不多见[15].因此,本研究对主要的3种乳腺炎病原菌进行了柑橘黄酮的抑菌实验,结果显示柑橘黄酮具有一定的抑菌作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的抑制作用次之.对于奶牛乳腺炎的发生，有研究发现金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌逐渐代替链球菌已成为引起奶牛乳腺炎的最重要致病菌，而干奶期乳腺炎病原菌以大肠杆菌为主[16].本研究结果表明柑橘黄酮对引起乳腺炎的主要病原菌金黄色葡萄球菌及大肠杆菌有显著的抑制作用.黄酮类化合物的化学结构属于酚类衍生物，柑橘黄酮的抑菌作用可能与其含有酚羟基苯环有关[17].酚类物质可通过破坏病原菌细胞壁和细胞膜的完整性，使微生物细胞释放胞内成分，导致膜的电子传递、营养吸收、核苷酸合成及三磷酸腺苷(ATP)活性等功能发生障碍，从而抑制微生物的生长.

综上所述，柑橘黄酮可预防乳腺炎的发生，该作用可能与其抑制细胞炎性反应的发生和对乳腺炎病原菌的抑制作用有关.虽然柑橘黄酮中总黄酮的含量较低(仅为12.3%)，但抑菌活性较强.由于柑橘果皮中含有丰富的柑橘黄酮，因此，柑橘黄酮有望作为奶牛的饲料添加剂以代替抗生素用于预防奶牛乳腺炎的发生.

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