拟南芥 At Suc3和 At Suc4基因的克隆及双价植物表达载体的构建

张彦伟,祝建波,沈海涛,王爱英,向本春

(石河子大学生命科学学院/石河子大学农业生物技术重点实验室,石河子832003)

拟南芥 At Suc3和 At Suc4基因的克隆及双价植物表达载体的构建

张彦伟,祝建波,沈海涛,王爱英,向本春

(石河子大学生命科学学院/石河子大学农业生物技术重点实验室,石河子832003)

蔗糖转运蛋白在调节同化产物的分配过程中起重要作用。为了分析拟南芥蔗糖转运蛋白基因 AtSuc3、At-Suc4的功能和协同作用,以哥伦比亚型拟南芥为材料,通过RT-PCR技术克隆了蔗糖转运蛋白基因(sucrose/H+cotransporters,SUCs)AtSuc3和 AtSuc4的cDNA,利用甘薯贮藏蛋白基因(sporamin)的根部特异性启动子,构建了含有含有AtSuc3和 AtSuc4 cDNA的单价植物表达载体pBI2301-q3-s3、pBI2301-q4-s4和双价植物表达载体pBI2301-q3-s3-q4-s4,为进一步分析该植物表达载体在调控库源关系中的作用以及在经济作物中的应用奠定基础。

蔗糖转运蛋白;AtSuc3;AtSuc4;植物表达载体;构建

蔗糖是植物光合作用同化产物最主要的转运形式,其转运的方向和速率对于高等植物的生长发育至关重要[1]。蔗糖由源向库的运输是通过韧皮部进行的。光合同化物进出韧皮部筛管分子是以两种不同模式转运的,即共质体途径和质外体途径[2]。其中蔗糖运输的质外体途径在许多农作物中占有重要的地位。在质外体途径中,叶肉细胞合成的同化物装入或卸出韧皮部筛管分子时都必须经由质膜,在质膜中存在有特殊转运蛋白(transporter),促进有机同化物的穿膜转运。这种特殊的转运蛋白即蔗糖转运蛋白(sucrose/H+cotransporters或 sucrose transporters,SUCs或 SU Ts),其在蔗糖转运过程中起着极为重要的作用[3～5]。

农业生产中,为了获得高产,不仅要设法提高光合作用形成的生物学产量,而且要通过一定的措施来提高经济学产量。利用蔗糖转运蛋白来定向的提高经济学的产量,是一种调控库源关系的有效手段。因此,分离、鉴定高等植物蔗糖转运蛋白,并对其功能进行深入研究,不仅具有深远的理论意义,而且对提高农作物的经济产量具有很高的实践价值。

目前,许多高等植物蔗糖转运蛋白的cDNA已被克隆。然而,目前关于AtSUC功能的信息多来自酵母突变体异体表达的研究结果。由于不同研究者选取的酵母菌株不同,试验选取的参数也不一致(例如p H值),所测结果不尽相同[6]。更主要的是在揭示不同的蔗糖转运蛋白基因的确切功能以及它们在植物体当中所起的生理作用上的研究还不够深入。

基于上述原因,本实验根据蔗糖转运蛋白在糖分积累中的作用,从调控源到库的关系的角度出发,利用分子生物学手段,从拟南芥中分别克隆AtSuc3和 AtSuc4基因,并利用甘薯贮藏蛋白基因(sporamin)的根部特异性启动子分别构建相应的单价和双价的植物表达载体,为进一步研究AtSuc3和 At-Suc4基因在转基因植物中调控蔗糖转运功能以及二者协同作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

大肠杆菌DH5α,哥伦比亚型拟南芥由石河子大学农业生物技术重点实验室保存,植物表达载体PBI121、p CAMBIA2301由本实验室保存。

1.1.2 限制性内切酶和主要试剂

XbaI、Sac I、Hind Ⅲ、Eco R Ⅰ、Dra Ⅲ、T4DNA ligase和 Taq酶均购于上海生工生物工程技术服务有限公司;p GM-T载体购于北京 Tiangen公司;DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京百泰克公司。

1.2 方法

1.2.1 根部特异性启动子的克隆

根据 Genebank收录的甘薯贮藏蛋白基因(sporamin)的根部特异性启动子序列(AF156697),利用PRIMER 5.0设计 PCR上游引物PR-1和下游引物PR-2、PR-3,并根据表达载体构建的需要,在上下游引物中分别加有不同酶切位点(HindⅢ、XbaⅠ、DraⅢ)。

取甘薯叶片作材料,利用SDS法提取总DNA。以提取的总DNA为模板,分别以 PR-1与 PR-2和PR-1与PR-3为引物进行扩增。PCR反应在PTC-0196 PCR仪上完成,反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性30s,56℃复性30s,72℃延伸30s,30个循环后72℃保温7min。产物经琼脂糖凝胶电泳分离后,回收目的片断与载体p GM-T Easy连接。混匀后,室温连接2h,然后16℃连接8h。转化感受态细胞,菌落PCR筛选阳性克隆,并进行酶切鉴定,然后进行测序分析。将测序正确的克隆分别命名p GM-Q3(PR-1/PR-2)和 p GM-Q4(PR-1/PR-3)。

1.2.2 At Suc3和 At Suc4的克隆

根据 Genebank收录的拟南芥 AtSuc3基因序列(NM_126341),设计 PCR引物 S3-1和 S3-2,并引入相应的酶切位点(XbaⅠ、SacⅠ),序列如下:

根据 Genebank收录的拟南芥 AtSuc4基因序列(NM_100870),设计 PCR引物 S4-1和 S4-2,并引入相应的酶切位点(DraⅢ),序列如下:

选取哥伦比亚型拟南芥的成熟叶子,利用TRNzol法提取RNA。先进行cDNA第一链反转录合成,再扩增目的基因。反应条件:94℃预变性5min,94℃30s,60℃45s,72℃2min,72℃10min。PCR产物经电泳后,回收目的片断与p GM-T easy载体连接,转化,筛选重组质粒,并进行酶切鉴定。将鉴定为阳性的克隆进行测序分析,分别命名为p GM-S3(At Suc3)和 p GM-S4(At Suc4)。

1.2.3 植物表达载体的构建

将植物表达载体pBI121经 HindⅢ/Sac I双酶切,回收载体大片段与经 HindⅢ/Sac I双酶切的p GM-Q3的目的片段连接,转化 DH5α,筛选重组子,命名为pBI121-Q3-GUS。

将植物表达载体pBI121-Q3-GUS经 HindⅢ/Eco RⅠ酶切,回收小片段(1个含有根部特异性启动子Q3的完整表达框)与经 HindⅢ/Eco RⅠ酶切的植物表达载体p CAMBIA2301的大片段连接,转化DH5α,筛选重组子,命名为pBI2301-Q3-GUS。

提取 pBI2301-Q3-GUS和 p GM-S3质粒,用XbaI/Sac I双酶切,回收载体片段和目的片断,连接,转化DH5α,筛选重组质粒,命名为pBI2301-Q3-S3。

提取p CAMBIA2301和p GM-Q4质粒,用HindⅢ/DraⅢ双酶切,回收载体片段和目的片断,提取p GM-S4质粒,用DraⅢ酶切,回收目的片断。将3个片段共连接,转化DH5α,筛选重组质粒,命名为pBI2301-Q4-S4。

提取 pBI2301-Q3-S3和 p GM-Q4质粒,采用HindⅢ/DraⅢ双酶切,回收载体片段和目的片断。提取p GM-S4质粒,用DraⅢ酶切,回收目的片断。将3个片段连接,转化DH5α,筛选重组质粒,命名为pBI2301-Q3-S3-Q4-S4。

2 结果与分析

2.1 根部特异性启动子的克隆和序列分析

甘薯基因组DNA通过PCR扩增,所得片段大小(365bp)与理论相符(图1)。目的片段分别克隆到p GM-T Easy载体后,对质粒经 HindⅢ/Xba I和HindⅢ/DraⅢ酶切鉴定,得到与预期大小一致的特异目的片段(图2、图3)。

将阳性克隆分别命名为p GM-Q3和p GM-Q4,送上海生工测序。通过序列分析,Q3和Q4与原序列相似性均达到99.43%。

图1 PCR扩增Q3和Q4的电泳结果Fig.1 Electrophoresis of Q3 and Q4 PCR products

图2 p GM-Q3的酶切电泳结果Fig.2 Identification of p GM-Q3 by restriction enzyme digestion

图3 p GM-Q4的酶切电泳结果Fig.3 Identification of p GM-Q4 by restriction enzyme digestion

2.2 AtSuc3基因的克隆和序列分析

拟南芥RNA通过RT-PCR扩增,得到1876bp的片段,大小与理论相符(图4)。目的片段克隆到p GM-T Easy载体后,对质粒经 XbaI/Sac I酶切鉴定,得到与预期大小一致的特异的目的片段(图5)。将阳性克隆命名为p GM-S3,送上海生工测序。通过序列分析,S3与原序列相似性达到99.95%,氨基酸序列比对相似性达到100%。

图4 PCR扩增S3的电泳结果Fig.4 Electrophoresis of S3 PCRproducts

图5 p GM-S3的酶切电泳结果Fig.5 Identification of p GM-S3 by restriction enzyme digestion

2.3 At Suc4基因的克隆和序列分析

拟南芥RNA通过RT-PCR扩增,得到1615bp的片段,大小与理论相符(图6)。目的片段克隆到p GM-T-Easy载体后,质粒经DraⅢ酶切鉴定,能得到与预期大小一致的特异的目的片段(图7),将阳性克隆命名为p GM-S4。送上海生工测序,通过序列分析。S4与原序列相似性达到99.75%,氨基酸序列比对相似性达到99.41%。

图6 PCR扩增S4的电泳结果Fig.6 Electrophoresis of S4 PCR products

图7 p GM-S4的酶切电泳结果Fig.7 Identification of p GM-S4 by restriction enzyme digestion

2.4 植物表达载体的构建

2.4.1 p BI121-Q3-GUS及p BI2301-Q3-S3的构建

将启动子Q3片段取代植物表达载体pBI121中的35S启动子,即构建成植物表达载体pBI121-Q3-GUS。提取 pBI121-Q3-GUS质粒,HindⅢ/XbaⅠ双酶切得到Q3启动子基因(图8)。

提取p BI2301-Q3-S3质粒,XbaI/Sac I双酶切得到 AtSuc3基因(图9)。

图8 pBI121-Q3-GUS的酶切鉴定Fig.8 Identification of pBI121-Q3-GUS by restriction enzyme digestion

图9 pBI2300-Q3-S3的酶切鉴定Fig.9 Identification of pBI2300-Q3-S3 by restriction enzyme digestion

2.4.2 p BI2301-Q4-S4的构建

提取pBI2301-Q4-S4质粒,DraⅢ酶切得到 At-Suc4基因(图10)。

图10 pBI2300-Q4-S4的酶切鉴定Fig.10 Identification of pBI2300-Q4-S4 by restriction enzyme digestion

2.4.3 pBI2301-Q3-S3-Q4-S4的构建

提取p BI2301-Q3-S3-Q4-S4质粒,DraⅢ酶切得到AtSuc4基因(图11)。结果与理论预期相一致。

图11 pBI2300-Q3-S3-Q4-S4的酶切鉴定Fig.11 Identification of pBI2300-Q3-S3-Q4-S4 by restriction enzyme digestion

3 讨论

植物SUC属于易化扩散载体超家族(major facilitator superfamily,MFS)中的糖转运家族的一个中等规模的亚家族[6]。目前,已有34种植物的69个SUC基因得到克隆,并通过生物信息学分析归为蔗糖转运蛋白家族,但是在这些基因之中只有20余个是经过初步的功能验证并确认为蔗糖转运蛋白的编码基因。

目前,从拟南芥的基因组中已纪鉴定出9个编码蔗糖转运蛋白的基因(AtSUC1～AtSUC9),其中AtSUC6、AtSUC7是假基因[8]。AtSU T4同时属于一种液泡载体,在叶肉细胞的液泡膜上有表达,负责蔗糖从细胞质跨膜进出液泡的运输,参与拟南芥叶肉细胞中蔗糖的液泡贮藏[9]。运用酵母异源表达系统对AtSU T4进行功能分析时发现,AtSU T4的表达可以促使酵母吸收蔗糖而生长,属于低亲和性/高转运能力(low-affinity-high-capacity,LA HC)一类,AtSU T4对蔗糖的亲和力较弱,但在蔗糖浓度高时却有助于大量蔗糖的转运,这类蔗糖转运蛋白主要参与高浓度蔗糖的转运步骤,向库组织大量转运蔗糖,并在决定库容大小上起主要作用,还可能参与蔗糖吸收效率的调控[10,11]。但是以往研究结果中表明,AtSU T4主要在拟南芥源叶片的次级叶脉伴胞中活跃表达,说明其主要功能仍是负责该部位的高通量韧皮部装载与运输[10]。

AtSUC3是该家族中基因和蛋白质结构最为特殊、功能最具争议的蔗糖转运蛋白。AtSUC3除在韧皮部的筛分子中表达外,在其它多种库细胞和组织中也表达且水平更高[12,13],例如在防卫细胞、毛状体、萌发的花粉、根尖、发育的种皮和托叶中都有表达,说明该基因除参与蔗糖的韧皮部装载外,其主要功能可能是向这些库供给生长发育所需的蔗糖[13]。但是Sauer实验室则认为 SU T2/SUC3类SUT可能并不参与蔗糖信号的感应与转运过程的调控[14]。

本实验成功克隆了 AtSU T3和 AtSU T4两个基因,并且构建了含有根部特异性启动子的植物表达载体 pBI2301-q3-s3、pBI2301-q4-s4、pBI2301-q3-s3-q4-s4,期望通过分子生物学手段,进一步验证蔗糖转运蛋白糖分积累中的独立或协同作用,并从库源关系入手分析 AtSUC3和 AtSU T4蔗糖转运蛋白基因在植物体库源调控当中所起的生理功能,进而为利用蔗糖转运蛋白来提高农作物的有效的经济产量奠定坚实理论和应用基础。

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The cDNA Cloning of AtSuc3 and AtSuc4 Gene from Arabidopsis thaliana and Construction of Plant Expression Vector

ZHANG Yanwei,ZHU Jianbo,SHEN Haitao,WANG Aiying,XIANGBenchun
(College of Life Science/Key Laboratory of Agricultural Biotechnology,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Sucrose transporter protein plays an important role in the regulation of distribution of assimilation products.In order to study the functions and synergies of Arabidopsis thaliana sucrose transporter gene AtSuc 3 and AtSuc4,cDNA sequences of the AtSuc3 and AtSuc4 protein were cloned from the A.thaliana ecotypes Colombia(Col-0).Monovalent and bivalent plant expression vector with sweet potato storage protein gene driven by root-specific promoter were constructed and named pBI2301-q3-s3,pBI2301-q4-s4 and pBI2301-q3-s3-q4-s4,respectively.This formed the basis for further study of the AtSuc3 and AtSuc4 function in the regulation treasury source relations.

sucrose transporter;At Suc3;AtSuc4;plant expressing vector;construction

Q782;S945.19

A

1007-7383(2010)01-0006-05

2009-04-23

张彦伟(1983-),男,硕士生,专业方向为植物基因工程;e-mail:honyred200@163.com。

向本春(1958-),男,教授,博士生导师,从事植物基因工程研究;e-mail:xbc@shzu.edu.cn。