ACC-β/CPT-1β基因多态性与有氧耐力的相关性研究

夏小慧2，胡扬，李燕春

●成果报告Short Communications

ACC-β/CPT-1β基因多态性与有氧耐力的相关性研究

夏小慧1，2，胡扬3，李燕春3

目的：探讨乙酰辅酶A羧化酶-β（ACC-β）和肉碱脂酰转移酶-1β（CPT-1β）基因多态性与有氧耐力的相关性，寻找与有氧耐力表型相关的遗传学分子标记。方法：应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱检测技术，对123名中国北方汉族优秀长跑运动员与127名中国北方汉族普通大学生ACC-β和CPT-1β基因区的5个SNP位点进行解析并比较分析。结果：运动员组5个SNP位点的基因型和等位基因频率与对照组相比均无显著性差异（P＞0.05）。ACC-β基因的rs2300455和rs2268393位点（D'=0.95，r2=0.161）存在强连锁不平衡。CPT-1β基因的rs470117和rs131758位点（D'=0.98，r2=0.535）存在强连锁不平衡。构建单体型分析，未发现不同单体型频率与有氧耐力表型相关联。结论：ACC-β基因rs2075260、rs2300455和rs2268393多态位点及CPT-1β基因rs470117、rs131758多态位点与有氧耐力不相关，不能作为耐力表型的遗传标记。

ACC-β；CPT-1β；基因多态性；有氧耐力；遗传标记

运动能力受众多遗传和环境因素的影响[1-2]，其形成非常复杂。从遗传角度来讲，与多对基因有关，属于多因子的复杂表型。近年来，大量研究通对可能影响有氧耐力的运动相关基因多态性进行研究，筛选影响表型形成的基因位点，旨在确定影响有氧耐力的遗传学标志，为优秀有氧耐力运动员选材提供依据。

高水平耐力运动员肌内线粒体氧化脂肪酸的能力强，有利于运动时节省糖储备。同时，当糖储存耗尽时，能够持续氧化脂肪酸提供运动肌所需能量，对提高有氧耐力十分有用。乙酰辅酶A羧化酶-β（ACC-β）和肉碱脂酰转移酶-1β（CPT-1β）主要存在于骨骼肌和心肌，是影响运动肌中长链脂肪酸进入线粒体的关键酶，在有氧耐力运动供能过程中起重要作用。当运动引起细胞内ATP下降时，长链脂肪酸进入线粒体，ACC-β的Ser218位被磷酸化[3]，并通过减弱丙二酰辅酶A（MCA）的活性调节β氧化过程中脂肪酸进入线粒体的限速酶CPT-1的作用[4-5]。

目前，尚没有对ACC-β和CPT-1β基因多态性与运动能力相关的报道。由于ACC-β和CPT-1β基因是骨骼肌和心肌脂肪酸代谢中的关键酶，而脂肪酸氧化能力对有氧耐力起重要作用，我们认为这两个基因是通过调节脂肪酸氧化而影响有氧耐力表型的微效基因，其基因多态性位点可能影响基因功能活性，从而影响有氧耐力。因此，本研究从两个基因区选择有代表性的多态位点，通过研究多态点在优秀耐力运动员与普通人群中的分布不同，探讨其作为影响有氧耐力遗传标记的可能性。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

运动员组123人，年龄为（15～38）岁，其中男性56人，女性67人。运动专项为5 000m、10 000m或马拉松跑，运动等级为健将或国际健将；普通人组127人，年龄为（18～22）岁，其中男性56人，女性67人，均无运动专业训练背景。所有受试者均来自山东、河北、东北3省。所有研究对象均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 肘静脉取血用W izard基因组DNA纯化试剂盒（Promega）从全血中提取基因组DNA。

1.2.2 多态位点检测根据文献研究报道[6-8]和SNP数据库资料，通过HapMap和Haploview软件分析，在ACC-β基因区选取3个标签SNP：rs2075260，rs2300455和rs2268393，在CPT-1β基因区选取了两个标签SNP：rs131758，rs470117。

SNP分型由Sequenom公司的MassARRAY系统完成。用基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF），引物延伸的方法进行多态位点解析。

用Assay Designer软件包设计包含目的多态位点的PCR引物和单碱基延伸引物。PCR扩增目的片段，针对SNP的单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应。将终止反应物脱盐后点样到spectroCHIP上，并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析。最终结果由MassARRAY RT软件系统（版本号3．0．0．4）实时读取，并由MassARRAY Typer软件系统（版本号3．4）完成基因分型分析。

PCR反应体系为：DNA样本：1μL（5 ng/μL）；PCR引物：1 μL；dNTP：1μL（2．5 mM）；MgCl2：0．325μL（25 mM）；HotStar Taq酶：0．1μL；PCR缓冲液：0．625μL；H2O：0．95μL。PCR反应条件：94℃15 min；94℃20 s，56℃30 s，72℃1 min，共45个循环；最后72℃3m in。

单碱基延伸反应体系为：H2O：0．755μL；10×iPLEX缓冲液：0．2μL；终止混合物：0．2μL、iPLEX酶：0．041μL，延伸引物：0．804 uL（10μM）。单碱基延伸反应条件：94°C 30 s；94℃5 s，52℃5 s，80℃5 s，共40个循环；最后72℃3m in。

表2 运动员组和对照组等位基因和基因型分布比较Table 2 Distribution and analysis ofallele and genotype frequency in athlete and controlgroup

1.2.3 统计学分析数据统计分析由shesis在线软件[9]完成。对每个位点进行等位基因频率、基因型频率统计，并对运动员组和对照组进行哈温平衡检测。对运动员组和对照组的等位基因和基因型频率进行卡方检测。不同位点进行两两的D'和r2计算，度量位点间连锁不平衡紧密程度。位于强连锁不平衡区的位点进行单倍型频率分析。P＜0．05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各位点完成检测样本数

对照组和运动员组各位点完成检测样本量见表1。

表1 各位点完成检测样本量Tab le 1 Sam p le num bers ofeach site

2.2 单个SNP位点与有氧耐力相关性

运动员组和对照组所有位点的等位基因和基因型频率均符合哈温平衡（见表2）。卡方检验结果显示，各位点运动员组和普通人组基因型和等位基因频率之间均无显著性差异（P＞0．05）。将运动员组按不同运动项目进行分组，分为马拉松项目组和5 000m/10 000m项目组，与对照组相比，各组间基因型和等位基因频率亦无显著性差异（P＞0．05，数据略）。

2.3 连锁不平衡和单体型分析

对不同位点进行两两的D'和r2计算结果显示，ACC-β基因的rs2300455和rs2268393位于强连锁不平衡状态（D'=0．95， r2=0．161），CPT-1β基因的rs470117和rs131758位点位于强连锁不平衡状态（D'=0．98，r2=0．535），而ACC-β基因的rs2075260与其他位点不处于连锁不平衡状态（D'＜0．33或/和r2＜0．1）[10]。ACC-β基因和CPT-1β基因内部处于强连锁不平衡的多态位点分别形成了3个单体型（所有频率小于0．03的基因型都被忽略)。经卡方检验，运动员组和对照组的单体型频率都没有显著性差异。同样，对照组与不同水平运动员组（分为马拉松项目组和5 000m/10 000m项目组）比较，也没有发现单体型频率与有氧耐力之间的相关性（P＞0．05，数据略）。

3 讨论

本研究首次探讨ACC-β和CPT-1β基因区SNP与有氧耐力之间可能的关联性。ACC-β和CPT-1β定位于与肥胖相关的基因区[11]。ACC-β基因区的rs2268393和rs2268391多态性与荷兰人的II型糖尿病相关，而其中rs2268393多态性与中国北方汉族人的II型糖尿病相关联[7]。在Julie的研究中，选择了CPT-1β基因区的9个多态位点，研究其与肥胖的相关性。结果显示rs131579和rs4701117位点多态性与肥胖显著相关[8]。另有研究从CPT-1β基因选择了3个多态位点，研究其与左心室指数之间的关联性[9]。这些研究结果显示，ACC-β和CPT-1β基因区域的位点多态性与能量代谢表型相关联。

经生物信息学软件分析，ACC-β位于染色体12q24．11。本研究选择的3个标签SNP分别位于外显子11（rs2300455，Ala/ Thr)，外显子46（rs2075260，Val/IIe)以及内含子16（rs2268393，C/T)，并在北方汉族人群中有较高杂合度。Rs2300455和rs2075260位点多态性引起所编码氨基酸的改变，从而可能改变蛋白质的性质。用DNAstar软件中Chou-Fasman方案预测，当rs2300455编码的氨基酸由Ala→Thr时，其二级结构中一个由12个氨基酸形成的β折叠结构被破坏，形成了一个由8个氨基酸形成的α-螺旋和一个由5个氨基酸形成的β折叠。rs2075260编码的氨基酸由Val→IIe时，该蛋白质的亲水性发生了变化，用K-D标准预测，亲水值从0.467上升到0.5。用NNSPLICE软件预测位于16号内含子处的rs2268393（C/T)位点的可能意义，结果显示当C→T时，该内含子区一个可变剪切位点值从0.74降为0.67。以上预测结果表明，这3个位点的多态性在一定程度上改变了相应蛋白质的理化性质，有可能进一步影响蛋白质的功能。

CPT-1β位于染色体22q13.33，研究报道染色体上该区域与运动相关能力表型有关。rs131758（5'UTR，A/T)和rs470117（3'UTR，A/G)位于基因调节区，可能通过影响启动子活性或者结合于miRNA而影响mRNA稳定性来影响基因的表达。

然而，本研究结果显示，所选的ACC-β和CPT-1β基因区的5个标签SNP多态性与有氧耐力无关。可能的原因如下:有氧耐力表型受多种遗传因素影响，其中生理因素主要指氧的供应和能量的供应两个方面。具体包括肺的通气功能、血液的载氧能力、心脏的射血能力、骨骼肌的有氧代谢能力以及能量物质的供应能力。每个因素对表型的影响都是重要的，但是对其影响程度无法量化。因此，脂肪酸氧化提高糖储备以及在长时间运动后期作为主要的能量物质氧化供能，可能是影响有氧耐力的因素之一，但ACC-β和CPT-1β基因的多态位点对有氧耐力表型影响的程度可能较弱。同时，有氧耐力的形成除了受微效基因的影响外，又受环境的影响，而环境因素的影响又是非常复杂，包括社会环境、自然环境等。

4 小结

本研究结果表明，ACC-β和CPT-1β基因是影响有氧耐力的微效基因，其基因区5个标签SNP多态性与有氧耐力表型的不相关，不能作为有氧耐力的遗传标记。

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Association Between ACC-β/CPT-1βPolymorphismsand Aerobic Endurance

XIA Xiaohui1，2，HU Yang3，LIYanchun3
（1．School of PE，Lanzhou City University，Lanzhou 730070，China；2．Graduate School，Beijing Sport University，Beijing 100084，China；3．Sports Research Center，Beijing Sport University，Beijing 100084，China）

Objective：Determiningwhether single nucleotide polymorphisms（SNPs）in the ACC-β/CPT-1βgenes region contribute to endurance exercise capacity and searching for genetic marks associated for aerobic endurance performance．Methods：Five SNPs in ACC-βand CPT-1βgene regionswere selected．The genotypes of the 123 elite long running athletes in the north of China and 127 college students in the north of China as controls were analyzed using thematrix assisted laser desorption ionisation-time of flightmass spectrometrymethod（MALDI-TOF）．Results：No differences were shown in allele and genotype frequenciesbetween the controls and the athletes（P＞0．05）．Rs2300455，rs2268393（D’=0．95，r2=0．161）were in a strong linkage disequilibrium block of ACC-βgene and rs470117，rs131758（D’=0．98，r2=0．535）in CPT-1βgene．No haplotypes of ACC-βand CPT-1βwere associated with endurance exercise capacity．Conclusion：Lack of association of ACC-β/CPT-1βpolymorphisms or haplotypes with Chinese elite endurance athletes and the selected SNPs failed to be a geneticmark of aerobic endurance performance．

ACC-β；CPT-1β；polymorphisms；aerobic endurance performance；geneticmark

G 804．23

A

1005-0000（2010）05-0373-02

2010-06-09；

2010-08-05；录用日期：2010-08-10

国家科技攻关计划项目（项目编号：2003BA904B04）

夏小慧（1973-），女，甘肃临洮人，讲师，北京体育大学在读博士研究生，研究方向为运动分子生物学。通讯作者：胡扬（1958-），男，江苏人，北京体育大学教授，博士生导师。

1.兰州城市学院体育学院，甘肃兰州730070；2.北京体育大学研究生院，北京100084；3.北京体育大学科研中心，北京100084。