有氧训练对雌性去卵巢小鼠海马区ChAT、AChE、nAChR mRNA基因表达的影响

孙 朋，李世昌，马 涛

●博士（生）论坛

有氧训练对雌性去卵巢小鼠海马区ChAT、AChE、nAChR mRNA基因表达的影响

孙 朋，李世昌，马 涛

目的：研究有氧训练对雌性去卵巢小鼠海马区ChAT、AChE、nAChRmRNA表达的影响。方法：24只8周龄雌性C57BL/6/Bkl小鼠分为3组，假手术安静组（Sham，n=8）、去卵巢安静组（OVX，n=8）、去卵巢运动组（OVX+EX，n=8）。对OVX+EX组进行8周有氧训练（40 min/次，5天/周），采用实时荧光定量PCR方法分析ChAT、AChE、nAChRmRNA的表达量。结果：与Sham组比较，OVX组和OVX+EX组ChAT、AChE、nAChRmRNA表达均下降（P＜0.01）；与OVX组比较OVX+EX组ChAT、nAChR mRNA表达上升（P＜0.01），AChE mRNA表达下降（P＜0.05）。结论：小鼠去卵巢后ChAT、AChE、nAChRmRNA表达均有所下降，有氧训练通过上调去卵巢小鼠海马组织中的ChAT、nAChR和下调AChE，增强其海马胆碱能系统功能。

有氧训练；去卵巢小鼠；ChAT；AChE；nAChR；mRNA

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，以进行性记忆能力损害和认知功能障碍为其主要的临床特征，目前研究认为AD与中枢胆碱能系统的关系极为密切[1]。海马的胆碱能系统直接参与信息的储存和回忆，胆碱乙酰转移酶（ChAT）及乙酰胆碱酯酶（AChE）是胆碱能神经元的标志酶，两者共同维持着中枢胆碱能系统重要的神经递质——乙酰胆碱（ACh）的动态平衡，ACh的含量与胆碱合成酶ChAT和水解酶AChE的含量和活性有关，它们在多种高级脑功能（包括学习、记忆过程）中发挥重要作用[2－3]。研究显示，AD病人海马区的ChAT和AChE的含量和活性出现异常[4]。烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）也是影响中枢胆碱能系统的重要因子[5－6]，相关研究研究发现AD病人nAChR水平出现下调[7－8]。

目前研究发现，AD的发病率存在性别的差异，女性和男性人数之比为2∶1～3∶1[9－11]。除了女性平均寿命较长的原因外，绝经后女性体内雌激素水平的迅速下降增加了其对AD的易感性[12]。研究显示，绝经前女性AD发病率远远低于同龄男性，而在绝经后女性AD的发病率迅速上升[13]，绝经后女性的发病率比同龄男性高2～3倍[11，14]。本实验利用雌性去卵巢小鼠模拟绝经后女性，通过有氧训练干预，检测其海马区ChAT、AChE、nAChR mRNA的表达量。

1 研究材料和方法

1.1 实验动物及饲养

8周龄清洁级雌性C57BL/6/Bkl小鼠24只，体重（21±2）g，购于上海西普尔－必凯实验动物有限公司，实验动物许可证编号：SCXK（沪）2008－0016。所有小鼠在华东师范大学动物饲养房分笼饲养，每个鼠笼4只，自由饮食，国家标准啮齿类动物常规饲料（由中国科学院上海实验动物中心提供）喂养。动物饲养环境温度（23±2）℃，湿度40%～60%，自然昼夜节律变化光照。

1.2 方 法

1.2.1 动物模型的建立及分组 24只8周龄雌性C57BL/6/Bkl小鼠随机分为假手术安静组（Sham，n=8）、去卵巢安静组（OVX，n=8）、去卵巢运动组（OVX+EX，n=8）。动物以1%的戊巴比妥钠（0.1 g/kg）腹腔麻醉后，剃除脊柱两侧的毛发，OVX和OVX+EX组分别在脊柱两侧摘除双侧卵巢，Sham组小鼠除去双侧卵巢周围少许脂肪组织，缝合切口，切口处给予少许青霉素粉剂。Sham组和OVX组不进行任何训练，OVX+EX组于术后第4天进行适应性训练两天，休息一天后进行正式训练。OVX+EX组以0.8 km/h的跑台（乔山跑台改装成动物跑台）速度进行训练，每次训练时间为40 min，每周训练5次（周五、周六停训），共训练8周，训练时间段在19：00～21：30，不使用光、电等刺激手段。

2结 果

2.1 ChAT实时荧光定量PCR检测结果

通过分析发现，雌性小鼠去卵巢后海马区ChAT mRNA的相对表达量在OVX和EX+OVX组中均显著下调（P＜0.01）。但是对去卵巢小鼠进行运动干预后，相对OVX组，EX+OVX组的ChAT mRNA相对表达量上调（P＜0.01）（见表2）。

2.2 AChE实时荧光定量PCR检测结果

对表3分析发现，去卵巢可使雌性小鼠海马区AChE mRNA相对表达量显著降低（P＜0.01）。同时发现，对去卵巢后雌性小鼠进行有氧运动干预的EX+OVX组比没有进行运动干预的OVX组海马区的AChE mRNA相对表达量要低（P＜0.05）。

注：**表示OVX组、EX+OVX组与Sham组比较，P＜0.01，▲▲表示EX+OVX组与OVX组比较，P＜0.01（下同）。

表3 小鼠海马区AChE mRNA相对表达量Table 3 The relative amount of expression of AChE mRNA in hippocampus（n=8）Groups Sham OVX EX+OVX 2-△△t 1.727±0.519 1±0.218＊＊ 0.896±0.107＊＊▲▲

2.3 nAChR实时荧光定量PCR检测结果

表4显示，OVX和EX+OVX组海马区nAChR mRNA相对表达量明显低于Sham组（P＜0.01）。此外，EX+OVX组海马区的nAChR mRNA相对表达量高于OVX组（P＜0.01）。

表4 小鼠海马区nAChR mRNA相对表达量Table 4 The relative amount of expression of nAChR mRNA in hippocampus（n=8）Groups Sham OVX EX+OVX 2-△△t 3.968±0.539 1±0.164＊＊ 1.397±0.215＊＊▲▲

3 讨 论

3.1 有氧训练对ChAT的影响

在神经细胞中ChAT催化胆碱和乙酰辅酶A合成ACh。在海马胆碱能系统中，ACh与ChAT高度一致，如果ChAT不足，会减少ACh的合成，导致神经元信息传递功能障碍，从而使学习与记忆功能减弱。AD病理生理学的主要因素就是ACh功能低下，即ChAT显著降低造成ACh合成减少[15]。

试验结果显示，与Sham组对比，OVX组和OVX+EX组小鼠海马区的ChAT mRNA表达均下调（P＜0.01）。说明去卵巢小鼠能有效模拟绝经后女性患AD的高风险因素。对去卵巢小鼠进行有氧训练干预结果显示，相对OVX组，OVX+EX组的ChAT mRNA表达上调（P＜0.01）。说明有氧运动能有效刺激ACh水平的限速酶ChAT的生成。Farmer的研究也发现，长期运动可使大鼠ChAT mRNA水平上调，增强海马神经突触可塑性和提高学习记忆力[16]。黄腊秀在研究不同强度运动对去卵巢大鼠ChAT表达的影响中发现，中等强度运动可上调去卵巢大鼠神经细胞中ChAT的表达[17]。有氧训练通过上调小鼠海马区ChAT，增加ACh的合成量，从而提高小鼠的学习记忆能力。Dunbar的研究发现，大鼠训练后，海马区ChAT和ACh均升高[18]。张辉通过对VD大鼠进行4周的运动训练发现，其学习、记忆能力明显增强[19]。

小鼠去卵巢后海马区ChAT下调引起ACh表达降低，从而损伤胆碱能系统，导致学习能力的降低。ChAT的下调可能是由于小鼠去卵巢后雌激素水平降低所引发。有氧训练可能机制为，通过改善小鼠体内雌激素水平达到上调ChAT。大量的基础研究显示，雌激素能够增加大脑皮层血液供应，提高海马区ChAT的水平[20－21]。Greene的研究发现，通过有氧训练，小鼠的E2上升，LH和FSH下降[20]。Simpkin通过给去卵巢大鼠注射E2，发现海马区ChAT水平上调。

3.2 有氧训练对AChE的影响

AChE是ACh的水解酶，也可作为ACh活性的标志。它能通过水解ACh，控制胆碱能神经元突触间的信息传递，从而实现对脑功能的调控。由于AChE活性在胆碱能神经元内较高，因此其活性可以反映胆碱能神经元的活性。有研究表明，老年性痴呆病人脑组织中AChE含量显著升高，使ACh分解速率增加，引起ACh下调，导致学习和认知能力下降[2]。有研究认为，通过测试AChE可以判断老年性痴呆大鼠的智能及记忆损害程度[22]。

有氧训练干预结果显示，AChE mRNA水平上OVX+EX组表达低于OVX组（P＜0.05），说明有氧运动通过下调小鼠海马区AChE生成量，降低ACh的水解速率，增加ACh合成量，从而增强海马胆碱能系统功能，提高小鼠学习和记忆能力。通过有氧训练干预下调AChE，调控ACh的合成量，从而预防AD的相关研究较少。大部分研究认为AChE是β－淀粉样肽的重要组分，通过下调AChE水平可以减少β－淀粉样肽的沉积，从而达到预防和治疗AD的效果[23－24]。

3.3 有氧训练对nAChR的影响

nAChR为配体门控的离子通道受体，属于半胱氨酸环受体家族，广泛分布于中枢和周围神经系统中。基本结构特征为5个不同亚基组成五聚体，以五角形排列，中央形成一个离子通道。各亚基的共同结构特征是含有4个跨膜螺旋结构，其中M2跨膜区位于内侧，构成离子通道的内衬面。M2螺旋上含有较多的酸性氨基酸残基，使通道形成负电位吸引阳离子，以此构成nAChR的阳离子通道特性[25]。中枢nAChR对于神经节传导及控制外周神经系统和中枢神经系统的功能十分重要，在脑中参与多种复杂的学习记忆功能。早在1986年，Whitehouse就首次提出脑组织内nAChR含量下降可能引发AD。相关研究也发现，AD患者神经元nAChR表达降低[8]。

通过试验结果分析，与Sham组对比，OVX组和OVX+EX组小鼠海马区的nAChR mRNA表达均出现下调（P＜0.01）。相对与OVX组OVX+EX组nAChR mRNA表达上调（P＜0.01）。小鼠去卵巢后，能够降低小鼠海马区nAChR的表达。如果实施有氧训练干预，可以上调去卵巢小鼠海马区nAChR mRNA，从而提高小鼠学习记忆能力，其结果与Swain[26]的研究一致，但是其具体机制尚不完全清楚。

4结 论

有氧训练可能通过上调雌性去卵巢小鼠海马区ChAT mRNA、nAChR mRNA和下调AChE mRNA，增加ACh合成量，增强中枢胆碱能神经系统的功能，从而提高其学习记忆能力。为临床防治绝经后女性AD等认知功能障碍性疾病提供理论和实验依据，但是其某些具体机制尚不完全清楚，有待进一步研究。

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Effect of Aerobic Training on ChAT，AChE，nAChR mRNA in Hippocampus of Female Ovariectomized Mice

SUN Peng，LI Shichang，MA Tao
（School of Sports&Health，East China Normal University，Shanghai 200241，China）

Objective：to study the effect of aerobic training on ChAT、AChE、nAChR mRNA in hippocampus of female ovariectomized mice.Methods：24 8－week－old C57BL/6/Bkl female mice were divided into 3 groups：Sham group（n=8），OVX group（n=8），OVX+EX group（n=8）.To undertake 8 weeks aerobic training（40 minutes/time，5 days/week）on the OVX+EX group，and then to analyze the ChAT，AChE，nAChR mRNA by Real－time PCR.Results：compared with Sham group，the ChAT，AChE，nAChR mRNA decreased（P＜0.01）in OVX group and OVX+EX group；compared with OVX group，the ChAT，nAChR mRNA increased（P＜0.01）and AChE mRNA decreased（P＜0.05）in OVX+EX group.Conclusion：There is a decrease expression of ChAT，AChE，nAChR mRNA in female ovariectmized mice，however，aerobic training can enhance their function of cholinergic system by increasing the expression of ChAT，nAChR and reducing AChE in hippocampus.

aerobic training；ovariectomized mice；ChAT；AChE；nAChR；mRNA

G 804.2

A

1005-0000（2010）06-0515-03

2010-08-12；

2010-10-22；录用日期：2010-10-25

孙 朋（1981-），男，山东高密人，在读博士研究生，研究方向为运动人体科学。

华东师范大学体育与健康学院，上海200241。

1.2.2 取 材 最后一次训练结束后第24～48 h内，小鼠断颈处死，无菌取小鼠海马，放入预冷的PBS缓冲液中漂洗干净，除去血液，滤纸吸干水分，迅速放入液氮中，最后放入－80℃冷冻箱保存，用于提取RNA。

1.2.3 逆转录与荧光定量PCR 从－80℃冷冻箱取出海马组织，加入液氮进行研磨，用Trizol一步法提取小鼠海马组织的总RNA，然后应用10 μL反应体系进行逆转录（其中5×Preme ScriptTM Buffer，2 μL；Preme ScriptTM RT Enzyme Mi×1，0.5 μL；Oligo dT Primer（50 μM），0.5 μL；Random 6 mers（100 μM），0.5 μL）。荧光定量PCR：（1）引物设计与合成：从美国国家生物信息中心的序列资料库（GeneBank）中查找小鼠ChAT、AChE、nAChR、Beta－actin（内参照）全基因序列，应用Primer Express 3.0软件设计引物，引物由上海生工生物技术有限公司合成（见表1）。

表1 PCR引物一览表
Table 1 PCR PrimerSequences and Amplicon Size

目的基因 引物 扩增片段长度ChAT 5'-AGGCCAGGACGGTCCTCTT-3' 66 5'-TGCAGCGCTCGATCATGT-3' AChE 5'-GGGCTCCTACTTTCTGGTTTACG-3' 71 5'-GGGCCCGGCTGATGAG-3' nAChR5'-AGCCTGAACGAGAAGGATGAAG-3' 63 5'-GTCGGTCCACTCCAGGTCTAAG-3' Beta-actin5'-CAATTCCATCATGAAGTGTGAC-3' 184 5'-CCACACAGAGTACTTGCGCTC-3'

（2）按照Applied Biosystems StepOneTM Real－Time PCR操作要求，采用20 μL反应体系：SYBRR Premix Ex TaqTM（2×），10.0 μL；上游引物0.4 μL；下游引物0.4 μL；ROX Reverence Dye（50×），0.4 μL；DNA模板，2.0 μL；dH2O，6.8 μL。采用两步法PCR扩增程序：Stage 1：95℃预变性30 s；Stage 2（40Reps）：95℃变性3 s，60℃退火30 s，每1℃收集荧光。结果显示熔解曲线只出现一个主波峰，说明PCR扩增的特异性较高，符合实时荧光定量PCR的技术要求。

1.2.4 统计学方法 SPSS 11.5软件对结果进行统计学处理，组间比较采用One－Way ANOVA分析，并用Tukey法检验组间差异显著性。检测结果以均数±标准差（±S）表示，以P＜0.05表示在统计学上有显著性差异，以P＜0.01表示在统计学上有极显著性差异。