RNA干涉技术及其在水产科学中的应用

李 兵 (华中农业大学水产学院，湖北 武汉 430070)

曾令兵 (中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北 荆州 434000)

RNA干涉技术及其在水产科学中的应用

李 兵 (华中农业大学水产学院，湖北 武汉 430070)

曾令兵 (中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北 荆州 434000)

介绍了RNA干涉的作用机制和特点，从抑制水生动物病毒、研究水生动物基因功能等方面综述了RNA干涉技术近年在水产科学领域中的应用。

RNA干涉；基因沉默；水产科学；应用

RNA干涉(RNA interference，RNAi)是指由外源或内源性的小干涉RNA双链分子(Small interferring RNA，siRNA)导入细胞时，引起同源的mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，又称为转录后基因沉默(post transcriptional gene-silencing，PTGS)[1，2]。

自从1998年Fire等提出RNA干涉以来，人们对它的机制以及功能的研究取得了突飞猛进的发展。RNA干涉技术具有高度特异性、高效性等特点，为人们研究未知功能的基因提供了新的遗传学手段，还可以作为一种潜在的抵抗病毒感染的途径。近年来科学家利用RNA干涉技术在研究水产病原生物控制、鱼类基因结构与功能等方面开展卓有成效的研究工作，取得了显著进展。

1 RNA干涉技术

1.1 RNAi的发展过程

1998年,Fire等[3]将经纯化得到的反义RNA或正义RNA注入线虫，基因抑制效应微弱；而将正、反义链构成的双链RNA注入线虫，结果诱发了比单独注射正义链或反义链都要强得多的基因沉默。由此他们提出，小的双链RNA分子能引起生物体内同源mRNA的降解，导致相应的基因表达沉默，并称这种现象为RNA干涉。

Wianny[4]发现 RNA干涉也存在于小鼠中。Clemens等[5]发现RNA干涉在体外培养的果蝇细胞系中也能实现。Brummelkamp等[6]利用载体表达的小发卡状RNA(small hairpin RNA，shRNA)在培养的人源、猴源和鼠源等哺乳动物细胞的RNAi实验中取得了成功。Tuschl等[7]发现小的RNA干涉分子(small interferring RNA，siRNA)能在人胚胎肾293细胞和Hela细胞内有效地抑制目的基因的表达。McCaffrey等[8]通过载体表达的shRNA在小鼠中成功抑制了HBV复制。Song等[9]针对小鼠Fas mRNA设计了siRNA，成功地保护了小鼠的肝脏。Anderson等[10]、Nishitsuji等[11]、Li等[12]、Tat等[13]分别利用RNA干涉原理有效地抑制了HIV-1的复制，为HIV-1的治疗提供了可能的途径。

1.2 RNAi的作用机制

RNAi的发生过程大致可以分为3个阶段，分别是起始阶段、效应阶段和扩增阶段。在起始阶段，外源导入或病毒感染等方式引入的dsRNA被核酸内切酶RNaseIII家族的Dicer所识别并均匀地切割成21～23 nt大小的siRNA。内源microRNA原始转录产物(pri-microRNA)在核酸内切酶Drosha的作用下形成microRNA前体(pre-microRNA)，然后被Dicer识别并结合，加工成类似siRNA的成熟microRNA[14]。在效应阶段，siRNA与蛋白复合物结合后形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC中的解旋酶利用ATP解开siRNA双链，反义链与Argonaute蛋白形成活化的RISC，活化的RISC与互补的靶mRNA结合，在酶的催化作用下，将其切割、降解[15]。在线虫和植物中存在这种siRNA的扩增机制。在这个阶段，siRNA与mRNA靶向性结合，并作为引物，在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)作用下再次形成dsRNA，dsRNA又被Dicer切割成siRNA，新形成的siRNA又可以进入下一轮循环而达到扩增目的[16]。

1.3 RNAi的特点

RNAi具有以下几个主要的特点：(1)高度特异性。RNAi作用只降解与其序列同源的靶mRNA分子。(2)高效性。由于RNAi过程中存在信号分子扩增机制，极少量的dsRNA就可以引起靶mRNA分子的降解[16]。(3)作用迅速。dsRNA导入细胞后可迅速引起与其同源的mRNA的降解。(4)能抑制静息期的病毒。RNAi的作用不依赖于病毒的复制，利用慢病毒载体表达的RNAi可以抑制处在静息期的病毒的基因表达。(5)能同时抑制多个基因。针对一个基因家族的保守序列设计siRNA能同时抑制该基因家族里的多个基因的表达。(6)操作简便。相对基因敲除技术而言，RNAi的操作更为简便，更易于控制。

1.4 siRNA的制备

制备siRNA较为常用的方法有化学合成法、体外转录法、长片断dsRNAs经Rnase Ⅲ类降解体外制备siRNA法、通过siRNA表达载体或者病毒载体制备siRNA以及通过PCR法制备的siRNA表达框架等。各方法的优缺点见表1。

表1 siRNA制备方法的比较Table 1 Comparison on methods of siRNA preparation

1.5 RNAi技术的应用

RNAi具有广泛的用途，例如用于基因功能解析、生物遗传育种、肿瘤与传染性疾病治疗、新型药物筛选、细胞信号传导途径、生长与发育机理等方面的研究。外源导入siRNA使生物体内同源的基因沉默而表现为相应的功能缺失的表型，就可以确定该基因的功能。在基因治疗研究中，选择病原生物、肿瘤细胞或遗传性、代谢性疾病特有的基因靶序列，设计siRNA并导入目标生物体内，从而引发RNA干涉，抑制靶基因的表达，达到基因治疗的目的。Gitlin等[24]发现，用siRNA预处理的人或鼠细胞能够抵抗脊髓灰质炎病毒感染，已感染脊髓灰质炎病毒细胞中导入siRNA有利于病毒的清除。RNAi可以作为寻找新的基因治疗药物靶标的工具，高通量地对药物靶基因作功能和效果分析。美国Genetica公司已将RNAi技术作为高通量药物靶标识别和确认的工具[25]。由于RNAi能高效地阻断目的基因的表达，因此RNAi技术可以作为研究信号传导通路的良好工具。Deng等[26]通过RNAi技术证实Mirk激酶在骨骼肌细胞分化过程中受Rho家族成员调控，联合应用传统突变缺失技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂信号传导通路中不同基因的上下游关系。

2 RNAi在抑制水产动物病毒复制方面的应用

随着水产养殖业的迅速发展，养殖环境的不断恶化，水产动物病害愈加频繁的发生。大规模疾病的暴发不仅造成了巨大的经济损失，由此滋生的滥用药物问题给食品安全带来了巨大的隐患，严重阻碍了水产养殖业的进一步发展。因此，有效控制水产动物病害的发生成为当务之急。但是，目前对水产动物疾病，尤其是病毒性疾病缺乏有效地防治方法，常规的药物防治不能有效控制疾病的发生，而且容易引起药物残留等问题。而小的RNA干涉分子能特异性地抑制同源基因的表达，利用RNAi干涉技术，通过外源导入siRNA可以在水产动物体内有效地降解病毒的RNA，达到防治病毒性疾病的目的。

2.1 抑制真鲷虹彩病毒

真鲷虹彩病毒能感染真鲷等海水养殖鱼类，造成较大的经济损失。目前对真鲷虹彩病毒还没有很好的抑制方法，因此很有必要研究一种新的途径来抑制真鲷虹彩病毒的复制。真鲷虹彩病毒是一种双链DNA病毒，病毒基因组编码一个主衣壳蛋白(major capsid protein，MCP)基因和92个推定的开放读码框架。Lua等[27]针对真鲷虹彩病毒(Red seabream iridovirus，RSIV)的主衣壳蛋白基因设计siRNA(siR-MCP)，用不同浓度的siR-MCP(30、60 和120 nmol/L)和MCP表达质粒共转染比目鱼胚胎细胞(Hirame Natural Embryo，HINAE)2 d后，经过RT-PCR的检测发现，120 nmol/L的siR-MCP能有效地抑制MCP基因的瞬时表达(表达量减少了79.55%)。用120 nmol/L的siR-MCP转染HINAE细胞6 h后，用RSIV感染HINAE细胞，继续培养72 h、84 h、96 h后，经过RT-PCR检测发现，RSIV的复制分别减少了13.04%、55.16%、97.14%。研究表明，通过siR-MCP抑制MCP基因的表达可以有效地抑制RSIV的复制。用siR-MCP转染HINAE细胞，接毒72 h、96 h、120 h后对细胞培养液的上清进行滴度测定，发现病毒的数量与对照组相比有所下降，表明siR-MCP有抗病毒的特性。由此提示RNA干涉技术可为水产动物病毒性疾病的防治提供了一种新的途径。

2.2 抑制对虾白斑综合症病毒

对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是一种双链环状DNA病毒，是造成世界范围内大面积暴发对虾病毒性疾病的主要病原。病毒感染虾后3～7 d内死亡率高达100%，对对虾养殖业造成了严重的危害。WSSV的基因组大小约为300 kb，由6个主蛋白和大约34个辅助蛋白组成。Westenberg等[28]针对对虾白斑综合症病毒包膜蛋白vp28和DNA绑定蛋白vp15设计了siRNA并注射到对虾体内，24 h后感染 WSSV病毒。发现siRNA能降低有效地抑制目的基因的表达，降低对虾的死亡率。Wu等[29]针对凡纳滨对虾白斑综合症病毒5个基因位点DNA 聚合酶(dnapol)，核苷酸还原酶小亚基(rr2)，胸苷激酶-胸苷酸激酶(tk-tmk)，核衣壳蛋白vp24以及包膜蛋白vp28设计了siRNA，将siRNA和WSSV注射到凡纳滨对虾第三腹节和第四腹节之间的肌肉组织，暂养6 d后，成活率分别为50%、50%、66%、33% 和33%，而对照组成活率为0%。说明siRNA对白斑综合症病毒的复制有一定的抑制作用，展示RNA干涉技术在防治病毒性疾病、尤其是目前尚无有效对策进行控制的病毒性疾病的广阔应用前景。

2.3 抑制蛙病毒

虎纹蛙虹彩病毒(Iridovirus-tiger frog virus，TFV)属于虹彩病毒科、蛙病毒属。虎纹蛙虹彩病毒主要感染虎纹蛙幼体和幼蛙，导致其大量死亡，造成重大的经济损失。虎纹蛙虹彩病毒免疫原性很低，疫苗接种的效果一般都不理想。RNA干涉作用具有高效降解同源mRNA的特点，解决了这一难题。Xie等[30]针对虎纹蛙虹彩病毒主衣壳蛋白基因设计的siRNA对病毒的复制有强烈的抑制作用。siRNA能导致TFV感染的细胞出现CPE的时间推迟。病毒感染后的细胞培养液中病毒的滴度和病毒粒子的含量均有下降。提示RNA干涉技术可以用于抑制虎纹蛙虹彩病毒的复制。他们还通过体外转录siRNA以及质粒转导shRNA在肥头鲤肌肉细胞(FHM)中有效地抑制了报告基因lacZ的表达，而且发现siRNA更为有效。

2.4 抑制草鱼呼肠孤病毒

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)主要感染当年草鱼种，在水温25～30 ℃最为流行，死亡率高。草鱼呼肠孤病毒为双链RNA病毒，其基因组由11个片段组成。陈芸[31]以草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白基因VP7为靶基因，构建了shRNA表达载体。转染草鱼肾细胞(CIK)后，用GCRV感染CIK细胞。结果显示，shRNA表达载体在细胞水平上对GCRV具有较强的病毒抑制作用，抑制率达82%。他们采用显微注射将shRNA表达载体导入稀有鮈鲫体内。结果表明，针对GCRV的VP7基因设计的shRNA表达载体有效地抑制了GCRV在稀有鮈鲫体内的复制。

3 RNAi在水产动物基因功能研究方面的应用

Li等[32]发现特异性的siRNA能有效地抑制斑马鱼胚胎中外源的绿色荧光蛋白的瞬时表达。针对Zf-T基因设计的siRNA通过显微注射到斑马鱼胚胎中，导致脊索发育畸形，尾部严重萎缩。 针对Pax6.1基因设计的siRNA导致斑马鱼胚胎眼和前脑发育不良。同时注射2种siRNA导致胚胎缺少脊索、眼以及部分脑组织。因此可以推测Zf-T基因与脊索的发育密切相关，Pax6.1基因在眼和脑组织的发育过程中起到了重要的作用。Dodd等[17]首次研究了siRNA对斑马鱼肌营养不良蛋白基因(dmdgene)的作用效果，应用化学合成的siRNA注射到斑马鱼胚胎中，成功抑制了dmd基因的表达。Liu等[18]发现运用核酶消化长片段dsRNA得到的siRNA能够引起非特异性的基因表达抑制，而运用SP6 RNA聚合酶进行体外合成得到的siRNA能够特异性的沉默靶基因的表达，说明体外转录的siRNA可以在斑马鱼中用来特异性地下调目的基因表达。这提示RNA干涉技术在斑马鱼基因功能研究中有着广泛的应用前景。

Boonanuntanasarn等[33]发现序列特异性的siRNA能有效地抑制虹鳟胚胎中绿色荧光蛋白基因的瞬时表达，有4个碱基错配的siRNA没有抑制效果。这说明siRNA的抑制作用具有高度特异性。针对酪氨酸酶A基因设计的siRNA，有效地抑制了酪氨酸酶A基因的表达，而且siRNA的抑制作用具有剂量依赖性。Robalino等[34]针对凡纳滨对虾的血蓝蛋白基因设计的dsRNA注射到对虾尾部肌肉，经过检测发现，dsRNA在肝胰腺中有效地抑制了血蓝蛋白mRNA的表达。说明dsRNA可以在对虾不同的组织间进行传递；对虾体内存在着完整的RNAi机制，因此RNA干涉技术可以用于研究对虾的基因功能。

Jannel等[35]通过体外转录法合成了针对罗非鱼肌生成抑制素myostatin基因设计的siRNA，通过显微注射到斑马鱼的晶胚中。在显微注射30 d、60 d和75 d后对所有鱼体进行称重，每组分别取20个个体进行肌肉的组织学分析。结果表明，注射了siRNA的斑马鱼与对照组相比，体重增长达到45%，肌纤维含量平均增长了48.7%。说明siRNA有效抑制了myostatin基因的表达，也提示RNA干涉技术可以用于培育个体大、肌纤维含量高的优良品种。

Zenke等[36]利用红鳍东方鲀的U6启动子成功的在蓝色大太阳鱼细胞系中转录了shRNA，并证实了在蓝色大太阳鱼细胞系、石鲈鳍条细胞系以及大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系中红鳍东方鲀的U6启动子比鼠的U6启动子能更有效地表达shRNA。Voelker等[37]利用RNAi技术抑制斑马鱼胚胎细胞色素cyp1a基因和血红素氧合酶1基因(hmox1)的表达，并将胚胎用3,4-氯苯胺(3,4-dichloroaniline)处理。结果胚胎发育紊乱的几率有所提高；而注射cyp1a和hmox1的mRNA减少了胚胎发育紊乱发生的几率。2种处理揭示了cyp1a和hmox1基因表达的蛋白对暴露于3,4-氯苯胺中的斑马鱼胚胎具有保护作用。进一步展示RNA干涉技术在基因功能研究方面的应用前景。

Su等[38]通过shRNA抑制斑马鱼绿色荧光蛋白基因和无尾基因的实验发现，相对于单独使用CMV启动子或者U6启动子而言，将CMV增强子或者整个CMV启动子定位于U6启动子的上游可以显著地增强shRNA对目的基因的抑制效果。Wang等[39]通过T7质粒系统体内转录小发夹RNA，有效地抑制了斑马鱼胚胎中绿色荧光蛋白基因和无尾(no tail)基因的表达。提示T7质粒系统体内转录小发夹RNA可应用于斑马鱼胚胎的基因功能研究。Schyth等[40]针对1种鱼类棒状病毒的糖蛋白基因设计了3种不同的siRNA，经病毒感染的细胞转染siRNA，结果显示3种siRNA均能有效地抑制病毒的增殖，而含1～4个碱基错配的siRNA，有2/3能对病毒起到抑制作用，说明siRNA的作用具有序列特异性。Hwang等[41]发现传染性胰腺坏死症病毒(infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)能诱导大麻哈鱼细胞产生一种新型的膜联蛋白1(annexin1)。他们针对膜联蛋白1设计了siRNA，有效地抑制了膜联蛋白1的mRNA的表达，经IPNV感染的细胞的凋亡现象显著增加，细胞外的病毒减少至25%。揭示大麻哈鱼膜联蛋白1的抗细胞凋亡作用对IPNV在细胞中的增殖十分重要。

4 问题与展望

RNAi具有高效性、特异性等诸多特点，在抑制特定基因的表达方面具有很大的优越性。RNAi技术可以广泛应用于水产动物基因结构与功能分析、细胞信号传导途径以及病原生物抑制与疫病控制等方面。由于化学合成siRNA的成本较高，且直接应用化学合成的siRNA其作用时效比较短，只适用于在细胞培养系统中用于筛选或鉴定有效siRNA结构。利用质粒转录或载体表达技术在鱼类细胞或鱼体内持续稳定高效表达siRNA结构，对于RNAi技术在鱼类传染性疾病的基因治疗、水产动物转基因新品种培育、遗传性状连锁基因定位、动物发育生物学等领域的应用有重要意义，是今后的研究于在水产科学中应用的发展方向。相信随着研究的不断深入，RNAi技术一定会在水产科学领域得到更加广泛的应用和取得更大的成果。

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Q789

A

1673-1409(2009)02-S042-06

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.02.013

2008-11-11

李 兵(1983-)，男，湖北麻城人，硕士研究生，主要从事水产养殖病害研究.

曾令兵，E-mail：zenglingbing@gmail.com.