XAF1基因诱导胰腺癌细胞株BxPC3凋亡的实验研究

黄佳 诸琦 曹海霞 姚玮艳 章永平 袁耀宗

·论著·

XAF1基因诱导胰腺癌细胞株BxPC3凋亡的实验研究

黄佳 诸琦 曹海霞 姚玮艳 章永平 袁耀宗

目的探讨Ad5/F35腺病毒介导的XAF1基因诱导胰腺癌细胞BxPC3凋亡及其可能的作用机制。方法将前期构建的重组腺病毒Ad5/F35-XAF1感染胰腺癌细胞BxPC3。采用半定量RT-PCR、蛋白质印迹检测法检测感染前后BxPC3细胞XAF1 mRNA和蛋白表达的变化；运用Annexin-V/PI和TUNEL法检测细胞的凋亡率；免疫蛋白印迹法检测细胞Caspase-3、PARP、Caspase-8和Bcl-2蛋白的表达。结果Ad5/F35-XAF1感染后，BxPC3细胞的XAF1 mRNA和蛋白表达明显增高，与空白组和Ad5/F35-Null对照组比较，差异显著(Plt;0.05)；两种方法检测的细胞凋亡率分别为(19.90±3.09)%、(9.29±2.13)%，较Ad5/F35-Null组的(6.72±0.76)%、(2.73±0.51)%和空白组的(7.22±1.53)%、(1.56±0.47)%均有显著差异(Plt;0.01)；Caspase-3、PARP、Caspase-8蛋白表达显著增强，Bcl-2表达降低。结论Ad5F35-XAF1重组腺病毒感染胰腺癌细胞BxPC-3能明显诱导细胞的凋亡，其机制可能是激活死亡受体途径和线粒体途径。

胰腺肿瘤； 腺病毒； XAF1基因; 细胞凋亡

X染色体连接的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis, XIAP)是凋亡核心介导因子——凋亡抑制蛋白家族中作用最强的成员[1]，而XIAP相关因子1(XIAP-Associated Factor 1,XAF1)是XIAP负性调节因子之一。它在所有胚胎组织及成人正常组织中广泛表达，但在许多肿瘤组织和肿瘤细胞株中低表达甚至不表达[2]，提示XAF1是一种潜在的肿瘤抑制因子。本实验应用前期构建的重组腺病毒Ad5/F35-XAF1[3]，观察其对胰腺癌细胞BxPC3凋亡的影响。

材料和方法

一、重组腺病毒感染人胰腺癌细胞株BxPC3

重组腺病毒Ad5/F35-XAF1及阴性对照腺病毒Ad5/F35-Null由本实验室前期构建。常规培养人胰腺癌细胞株BxPC3，细胞贴壁生长24 h后，将Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-Null用无血清DMEM培养基稀释后感染细胞。2 h后更换含10%胎牛血清的培养液，常规培养箱中培养48 h。

二、XAF1mRNA检测

采用Trizol(Invitrogen公司)法提取细胞总RNA。运用MMLV第一链cDNA合成试剂盒(上海生工生物公司)合成cDNA。XAF1引物序列：上游5′-TCCGGAATTCATGCTCCACGAGTCCTACTG-3′,下游5′-ACGCGTCGACAAACTCTGAGTCTGGACAAC-3′,产物大小260 bp；β-actin引物序列：上游5′-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGC-3′,下游5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′,产物大小830 bp。PCR反应后产物行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，Bio-rad凝胶成像系统摄影。

三、XAF1、Caspase-3、PARP 、Caspase-8和Bcl-2蛋白检测

用细胞裂解液(申能博彩公司)抽提细胞总蛋白。取20 μg蛋白常规行免疫蛋白印迹。抗β-actin一抗1∶5000稀释，抗XAF1一抗、抗Caspase-3、抗PARP、抗Caspase-8和抗Bcl-2一抗均1∶1000稀释。最后ECL显影。

四、细胞凋亡率检测

取Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-Null感染细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为105～106个/ml。取细胞悬液490 μl，应用Annexin-V/PI法及TUNEL法检测细胞凋亡率，均重复3次。

五、统计学分析

用SPSS13.0统计软件进行分析。多组间均数比较采用单向方差分析，计数资料采用χ2检验，Plt;0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、BxPC3细胞的XAF1 mRNA 和蛋白的表达

Ad5/F35-XAF1感染BxPC3细胞48 h后，XAF1 mRNA和蛋白的表达明显增高，而空白组和Ad5/F35-Null组细胞的XAF1 mRNA和蛋白的表达水平很低或不表达(图1)，差异具有显著性(Plt;0.05)。

二、BxPC3细胞凋亡率的变化

采用Annexin-V/PI法，Ad5/F35-XAF1感染BxPC3细胞48 h后，早期凋亡率为(19.90±3.09)%，与Ad5/F35-Null组(6.72±0.76)%和空白组(7.22±1.53)%相比，差异显著(图2，Plt;0.01)；采用TUNEL法，感染BxPC3细胞48 h后细胞的凋亡率为(9.29±2.13)%，而Ad5/F35-Null组和空白组分别为(2.73±0.51)%和(1.56±0.47)%，差异均具有显著性(图3，Plt;0.01)。

图1 感染前(下)、后(上)BxPC3细胞XAF1的表达

图2 流式细胞仪检测BxPC3细胞凋亡率

三、BxPC3细胞Caspase-3、PARP、Caspase-8和Bcl-2蛋白表达的变化

Ad5/F35-XAF1感染后，BxPC3细胞Caspase-3、PARP和Caspase-8蛋白表达显著增强，而Bcl-2的表达明显降低，较Ad5/F35-Null组和空白组均有显著性差异(图4)。

图3TUNEL法检测Ad5/F35-XAF1感染48 h后BxPC3细胞的凋亡

图4 各组BxPC3细胞凋亡相关蛋白的表达

讨 论

XAF1是新近发现的一种肿瘤抑制基因，能通过细胞外信号调节激酶途径促进结肠癌细胞的凋亡[4]，并且可以增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物致凋亡作用的敏感性[5]。小鼠内皮细胞过度表达XAF1，能诱导内皮细胞的凋亡并且抑制血管的生成[6]。史冬梅等[7]报道XAF1能抑制肝癌细胞的增殖和诱导凋亡，并增加肝癌细胞对5-氟尿嘧啶和羟基喜树碱的敏感性。本实验结果显示，重组腺病毒Ad5/F35-XAF1感染胰腺癌细胞BxPC3 48 h后，XAF1 mRNA和蛋白的表达明显增高，凋亡率显著增加，说明胰腺癌细胞过度表达XAF1能够明显诱导细胞的凋亡。

Liston等[8]研究发现，XAF1与XIAP结合后使其重定位于细胞核，它通过竞争性拮抗XIAP对caspase-3的抑制作用以激活Caspase-3，-7，-9的活性。本结果显示，胰腺癌细胞株BxPC3过度表达XAF1后，caspase-3、PARP和caspase-8的活化都明显增强。新近的研究表明，除了拮抗XIAP的作用之外，XAF1还能激活线粒体凋亡途径，促进细胞色素C的释放，进而增强TNFα诱导的由死亡受体介导的凋亡作用[9-10]。胰腺Bcl-2是一种原癌基因，过度表达的Bcl-2能抑制线粒体的通透性，阻止细胞色素C等凋亡蛋白释放到胞质中从而抑制细胞凋亡[11]。本实验证实，胰腺癌细胞株BxPC3过度表达XAF1后，Bcl-2的表达水平较对照组明显降低，说明线粒体途径也可能参与XAF1诱导的胰腺癌细胞的凋亡。

[1] Deveraux QL,Reed JC.IAP family proteins-suppressor of apoptosis.Genes Dev，1999,13:239-252.

[2] Liston P,Fong WG,Korneluk RG．The inhibitors of apoptosis：there is more to life than Bcl2.Oncogene,2003,22:8568-8580.

[3] 康焱，廖威明，袁振华，等.重组35型腺病毒介导人骨形成蛋白基因对脂肪源性干细胞的诱导分化.中国修复重建外科杂志,2007,21:125-129.

[4] Yu LF,Wang J,Zou B，et al.XAF1 mediates apoptosis through an extracellular signal-regulated kinase pathway in colon cancer.Cancer,2007,10:1996-2003.

[5] Leaman DW,Chawla-Sarkar M,Vyas K,et al.Identification of X-linked inhibitor of apoptosis-associated factor-1 as an interferon-stimulated gene that augments TRAIL Apo2L-induced apoptosis.J Biol Chem,2002,277:28504-28511.

[6] Qiao L,Gu Q,Dai Y,et al.XIAP-associated factor 1 (XAF1) suppresses angiogenesis in mouse endothelial cells.Tumour Biol,2008,29:122-129.

[7] 史冬梅,马天乐,涂水平,等.X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1抑制肝癌细胞增殖和诱导凋亡的实验研究.中华消化杂志,2006,26:682-685.

[8] Liston P,Fong WG,Kelly NL,et al.Identification of XAF1 as an antagonist of XIAP anti-Caspase activity.Nat Cell Biol,2001,3:128-133.

[9] Xia Y,Novak R,Lewis J,et al.Xaf1 can cooperate with TNFalpha in the induction of apoptosis,independently of interaction with XIAP.Mol Cell Biochem,2006,286:67-76.

[10] Straszewski-Chavez SL,Visintin IP,Karassina N,et al.XAF1 mediates tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis and X-linked inhibitor of apoptosis cleavage by acting through the mitochondrial pathway.J Biol Chem,2007,282:13059-13072.

[11] Yang J,Liu X,Bhalla K,et al.Prevention of apoptosis by Bcl-2:release of cytochrome c from mitochondria blocked.Science,1997,275:1129-1132.

2008-12-10)

(本文编辑：吕芳萍)

XAF1genemediatedbyrecombinantadenovirusinducesapoptosisinpancreaticcelllineBxPC-3

HUANG Jia,ZHU Qi,CAO Hai-xia,YAO Wei-yan,ZHANG Yong-ping,YUAN Yao-zong.

Department of Gastroenterology, Ruijin Hospital,Medical School, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025,China

ZHUQi,Emailzhuqi@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate whether expression of XAF1 mediated by adenovirus vector Ad5/F35 could induce apoptosis in pancreatic cancer cell line BxPC-3 and its possible mechanisms.MethodsPre-constructed recombinant Ad5/F35-XAF1 virus and negative control Ad5/F35-Null was tranfected into BxPC3; the expression of XAF1 mRNA and protein before and after tranfection was analyzed by semi-quantitative RT-PCR and Western blot. The expressions of proteins including Caspase-3, PARP, Caspase-8 and bcl-2 were detected by Western blots. Cell apoptosis was assessed by Annexin-V/PI and TUNEL staining.ResultsAfter Ad5/F35-XAF1 tranfection, XAF1 mRNA and protein expression significantly increased, and the difference was statistically significant when compared with control group and Ad5/F35-Null group (Plt;0.05). The apoptosis rate was (19.90±3.09)% and (9.29±2.13)%, which was significantly different (Plt;0.01) from those in the Ad5/F35-Null group [(6.72±0.7)6%, (2.73±0.51)%] or in the control group [(7.22±1.53)%, (1.56±0.47)%]. The expression of Caspase-3, PARP and Caspase-8 significantly increased, but the expression of bcl-2 decreased.ConclusionsXAF1 plays a major role in the apoptosis of pancreatic cancer that acts through the activation of death receptor pathway and mitochondrial pathway of apoptosis.

Pancreatic neoplasms; Adenoviruses; XAF1 genes; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.016

200025 上海，上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科

诸琦，Email:zhuqi@medmail.com.cn