番鸭小鹅瘟病毒云浮株的分离与鉴定

周　全　宋永峰　周　丽　黎　敏　高　恒　宋延华　温纳相

【摘要】2008年初, 广东云浮思劳片区番鸭养殖场出现下痢、张口呼吸、脚软、堆积、采食量减少等症状。发病后的前3天曾经用过抗生素治疗,但没有效果,死亡率高达80%。病理解剖主要表现为肠道中后段膨大约3倍、整个肠道出血严重 ,有凝固性栓子。肝脏肿大,胆囊明显膨大,肾脏肿胀。为查明原因,笔者对发病的雏鸭进行病毒的分离与鉴定工作,通过病毒分离、PCR、琼脂扩散和动物回归试验证实获得1株番鸭小鹅瘟病毒。经番鸭胚接种、雏番鸭攻毒试验,证实所分离的病毒具有较强的致病性。

【关键词】番鸭 小鹅瘟病毒 分离鉴定

小鹅瘟是由鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起的1-5周龄雏番鸭和雏鹅的一种急性或亚急性、高度接触性传染病[ 1 ]。该病最早由我国著名学者方定一于1956年首次发现[ 2 ],并于1961年在鹅胚中分离到该病毒,目前已呈世界性分布[ 3 ]。临诊症状表现为雏番鸭纤维素性肠炎、小肠后段内容物形成腊肠样栓子及肝、肾、心等实质脏器的炎症,可引起雏番鸭20%-90%的死亡率,是严重危害番鸭养殖的重要病毒病[ 4 ]。本研究对一份疑似番鸭小鹅瘟病料进行了病毒分离鉴定,现将结果汇报如下:

1.材料与方法

1.1 材料

疑似番鸭小鹅瘟病料采自广东省云浮市某番鸭场,健康非免疫番鸭胚和雏番鸭均由思劳孵化厂提供,标准阳性毒株由本室保存,阳性血清由动物防疫站惠赠。

1.2 方法

1.2.1 临床症状与剖检变化 雏番鸭死前腹泻严重,粪便呈褐色,濒死期角弓反张,个别有神经症状。经剖检可见整个肠道充血、出血严重;肠道后段有栓子,肝、胆囊肿大充血、淤血。

1.2.2 病料的处理 无菌采取疑似感染小鹅瘟濒死病番鸭的肝脏、肾脏和脾脏,将病料剪碎研磨后,按1∶3比例加入生理盐水,制成悬液。-70℃/37℃反复冻融3次,10000r/min离心10min,取上清,过滤除菌后-20℃保存备用。

1.2.3番鸭胚接种 取上述病毒液以尿囊腔途径接种12日龄健康非免疫番鸭胚10枚,每枚0.2mL,同时设生理盐水及空白对照组。37℃培养,每日观察番鸭胚发育和死亡情况,弃去24h内死亡胚,无菌收集接种后3～7d死亡的番鸭胚和活胚的尿囊液,经无菌检验后,低温保存备用,同时取出胚体观察其病理变化。

1.2.4鸭胚成纤维细胞培养 按常规方法制备鸭胚原代成纤维细胞(DEF),当DEF长至70%～80%单层时,将GPV病毒液接种于细胞中,37℃培养,观察细胞病变。

1.2.5琼脂扩散试验 按常规方法应用标准阳性血清和分离病毒的番鸭胚尿囊液进行琼脂扩散试验。

1.2.6 PCR检测 根据参考文献合成小鹅瘟检测引物,常规方法提取样品DNA,进行PCR检测;目的片段约为600bp。

1.2.7病毒致病性测定 将80只雏番鸭随机分成8组。前7组分别注射10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7倍稀释含小鹅瘟病毒的番鸭胚尿囊液,接种量为肌注0.2mL/只,第8组为对照组。分别隔离饲养,连续观察,记录死亡情况。按Reed-Muench法计算LD50。

1.2.8动物回归试验 将20只12日龄雏番鸭随机分为2组,每组10只,一组为试验组,肌注0.5 mL/只分离的病毒,另一组肌注0.5mL/只生理盐水作为对照组,相同条件下隔离饲养,观察15天。

2 结果与分析

2.1 剖检变化

2.2番鸭胚接种试验 将待检病料接种于10只番鸭胚,24h内没有发现番鸭胚死亡,番鸭胚在24h-96h死亡8枚。胚体观典型的病变主要为绒毛尿囊膜水肿,有灰白色针尖状小点;胚体充血、出血;喙、趾、颈部皮肤等均有明显出血点;肝脏充血,心肌、后脑出血,头、颈部及两肋皮下有水肿,出现小鹅瘟临床症状和剖检特征。结果见图3。

2.3鸭胚成纤维细胞培养试验 DEF接种病毒后,纺锤形的鸭胚成纤维细胞出现圆缩、脱落等明显的病变,说明病毒能在番鸭胚原代细胞中增殖,结果见图4、图5。

2.4琼脂扩散试验 分别用标准阳性血清与培养的病毒进行琼脂扩散试验。中央孔为标准阳性血清,外周为6份培养病毒的番鸭胚尿囊液,每孔加入200uL,酒精灯封底后,置37℃湿盒中,温育48h后,观察结果,可见6份尿囊液均与标准阳性血清形成明显的沉淀线,结果见图6。

2.5 PCR检测 按照参考文献的方法进行PCR扩增,电泳结果可见到清晰的目的条带,即GPV PCR阳性,见图7。

1:阳性对照、2:阴性对照、3:分离毒株、M:marker2000

2.6病毒致病性测定

将不同稀释度的含病毒的番鸭胚尿囊液接种健康非免疫番鸭后,连续观察9d,记录死亡情况,用Reed-Muench法计算。

从下表可以看出,该毒株的LD50在10-4和10-5之间,按公式计算(62- 50)/(62- 33)=12/29=0.4,根据统计学的方法得出分离毒株的LD50= 10-4.6/0.2mL。

2.7动物回归试验结果

接种含毒尿囊液的雏番鸭于接种后第5天开始出现症状,接毒组出现轻微的腹泻、不愿走动、精神萎顿、食欲减退;后期严重腹泻,呼吸困难,两脚麻痹,行走困难,卧地不起,发病率为100%。

剖检可见小肠粘膜充血或出血,肝脏稍肿大,呈深紫色,表面有出血点;胆囊明显膨大,充满暗绿色胆汁;肠粘膜弥散性出血,肠道尤其是靠近回盲部的肠段呈现典型的卡他性、纤维素性、坏死性肠炎的变化,质地坚实,似香肠样,坏死的肠粘膜、渗出的纤维素等凝固形成的栓子。阴性对照组的10只雏番鸭正常。

3. 小结和讨论

3.1 尽管小鹅瘟病毒的血清型只有一种,其自然感染宿主也只有雏番鸭和雏鹅, 但近年来研究发现不同地区分离毒株毒力不同[ 8,9 ], 使该病难于预防和治疗, 这也是常规疫苗的免疫保护失败的主要原因[ 11 ]。

3.2 本试验分离的小鹅瘟地方株能使番鸭胚产生特征性病变;在动物回归试验中, 可使雏番鸭出现典型小鹅瘟症状;本病毒能被小鹅瘟阳性血清中和;分离毒株这些特性与鹅细小病毒一致, 确认所分离病毒株为鹅细小病毒[ 12 ], 该病毒是雏番鸭和雏鹅疫病的主要病原之一, 对番鸭养殖业危害极大[ 13 ]。

参考文献:

[ 1 ]蔡宝祥. 家畜传染病学(第四版) [M] . 北京:中国农业出版社,2001 ,334 - 336.

[ 2 ]方定一. 小鹅瘟的介绍[J] . 中国畜牧兽医医学杂志,1998 ,5 (7) :19 - 20.

[ 3 ]殷震, 刘景华. 动物病毒学[M].2 版.北京: 科学出版社, 1997: 1165- 1168.

[ 4 ] 胡桂学,高光,邹啸环. 小鹅瘟病毒分离与初步鉴定[J] . 经济动物学报,2002 ,6 (2) :41 - 43.

[ 5 ] 唐桂远,武华泽. 禽病原分离鉴定手册[M] . 北京:农业出版社,1993 :208 - 229.

[ 6 ] 刘登明,廖德惠,谢竟怀. 小鹅瘟病毒提纯的研究[J] . 中国畜禽传染病,1989 , (6) :47 - 48.

[ 7 ] 李桂霞, 刘胜旺, 孔宪刚 等.鹅细小病毒HG5/82 株的分离鉴定及生物学特性的研究[J].中国预防兽医学报, 2005, 27(3): 196- 201.

[ 8 ] 周瑞进, 布日额, 韩先杰 等.鹅细小病毒免疫血清的制备及其应用[J].中国兽医科技, 2004, 12( 34) : 63- 66.

[ 9 ] 布日额, 王君伟, 吴金花等.GPV 野毒株鉴定及其致病力试验[J].中国家禽, 2003, 16( 25) : 8- 10.

[ 10 ] 赵爱玲. 小鹅瘟的诊断及病毒分离鉴定[J] . 畜牧兽医科技信息,2005 ,11 :91.

[ 11 ] 陈晓月,赵承辉,刘爽. 小鹅瘟地方株的分离鉴定及致病力试验[J] . 沈阳农业大学学报,2007 ,38 (3) :410 - 412.

[ 12 ] 吴继秋,李东华,金红范等. 小鹅瘟病毒的分离与初步鉴定[J] . 延边大学农学学报,2005 ,3 (1) :26 - 30.

[ 13 ] 李云龙,于 刚,姜凤华等. 小鹅瘟病原分离及鉴定[J] . 现代畜牧兽医,2008 ,3 :39 - 40.

作者简介:周全(1982-),男,湖北黄冈人,本科,现于广东温氏食品集团研究院工作,主要从事禽病相关研究工作。