反胶团萃取分离纯化色氨酸的研究

司晶星

摘要:色氨酸是人体内的必需氨基酸之一。针对色氨酸的分离纯化,提出一种基于反胶团法的分离纯化方法。结果表明,采用AOT/异辛烷反胶团体系,在AOT浓度60mmol/L;;萃取pH为2.0;离子强度为0.1mol/L;反萃取PH为10;离子强度为1mol/L的条件下,经过一次萃取,回收率可以达到70%左右。

关键词:色氨酸 反胶团 AOT 萃取

0 引言

色氨酸是人体内的必需氨基酸之一。色氨酸对人和动物的生长发育、新陈代谢起重要的作用,对预防糙皮病、抑郁症,改善睡眠和增强自信心有着很重要的作用,广泛应用于医药、食品和饲料行业。反胶团是针对于生物活性的氨基酸或蛋白质提出的一种液液萃取体系。同传统氨基酸分离纯化手段相比,它具有分离步骤少、易于放大、高选择性、低成本的特点。从20世纪70年代末反胶团概念的提出到现在,它一直是生化工程研究领域的热点。在研究利用反胶团从实际复杂体系(如发酵液中)分离纯化目标蛋白时,如果直接从复杂体系入手,盲目性很强,很难对萃取过程或出现的问题进行准确的分析和判断。而从模拟体系入手,在研究清楚萃取过程的主要规律后,再进行复杂体系的研究,是一种事半功倍的研究思路。作者通过正交实验分析方法,研究了反胶团体系中AOT浓度、萃取PH、萃取离子强度、反萃PH和反萃离子强度五个因素对色氨酸萃取的影响,从而推断出最优方案。

1 材料与方法

1.1 实验材料 AOT(丁二酸-2-乙基己基磺酸钠)购自嘉善巨枫化工厂,异辛烷购自天津市福晨化学试剂厂,其他试剂购自上海苏懿化学试剂有限公司,均为分析纯。水溶液均用去离子水配制,实验在室温下进行。

1.2 萃取与反萃实验 将适量的AOT加入到异辛烷溶液中摇匀,使其均匀分布于有机相,得到澄清透明稳定的反胶团系统。准确量取1mL色氨酸储备液于不同缓冲液中,稀释,由不同浓度的离子构成酸缓冲液,PHPI)的离子强度的缓冲液作为反萃取水相,与前萃取所得的有机相混合,放在振荡机上剧烈摇晃后20min,倾入离心管,进行离心。用滴管小心地将两相分开,下层水相即为纯化的色氨酸。

1.3 色氨酸含量分析 利用对二甲氨基苯甲醛法测量水相中色氨酸含量。在752紫外光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)上测定600nm处的吸光度,对照标准浓度-吸收度曲线,以计算色氨酸的浓度。色氨酸测量范围为0-100μg/mL。

2 实验结果与讨论

反胶团体系影响因素很多,需要对各个条件进行优化,选择色氨酸萃取最佳条件,但是各个因素太复杂,如果每个因素都分开讨论,工作量很大,而且需要很长时间,因此在实际实验中采用正交实验的方法。正交试验设计是利用“正交表”进行科学地安排与分析多因素试验的方法。其主要优点是能在很多试验方案中挑选出代表性强的少数几个试验方案,并且通过这少数试验方案的试验结果的分析,推断出最优方案,同时还可以作进一步的分析,得到比试验结果本身给出的还要多的有关各因素的信息。

在本次实验中,对AOT浓度、萃取pH、萃取离子强度、反萃pH、反萃离子强度这五个因素进行考虑。

固定以下几个条件:

色氨酸储备液单位为1mg/ml;有机溶剂为异辛烷;表面活性剂为AOT;无助表面活性剂;萃取和反萃相比为1:1;萃取和反萃离子都为KCL;萃取时间15min;离心(3500r/min,5min);反萃时间为20min;离心(3500r/min,5min),萃取温度为室温。实验的各因素级水平如(表3-1):

取16个100mL的三角瓶,并依次编号,按照所述实验步骤进行操作,固定条件不变,但是对涉及正交的几个因素的种类和加入量按照表3-2进行试剂的正确加入,采用正交表进行实验,结果如下:

2.1 PH对萃取过程的影响 水相的PH值决定了色氨酸表面电荷的状态,从而对萃取过程造成影响,由于AOT为阴离子表面活性剂,在进行萃取过程中应该是PH

在进行反萃取过程中PH>PI,当PH值小于10时,萃取率较低;在PH>10.0时,随着PH的升高,萃取率明显升高,以PH值11.0的萃取效果为最好,但是当PH>12时,萃取效率降低。

2.2 离子强度对萃取过程的影响 离子强度对蛋白质萃取有几方面的影响:一是离子强度增大后,反胶束内表面的双电层变薄,减弱了蛋白质与反胶束内表面之间的静电吸引,从而减少蛋白质的溶解度;二是反胶束内表面的双电层变薄后,也减弱了表面活性剂极性头之间的斥力,使反胶束变小,从而使蛋白质不能进入其中;三是离子强度增强时,增大了离子向反胶束“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向,使蛋白质从反胶束内被盐析出来;四是盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用,可改变溶解性能,盐的浓度越高,其影响就越大。显示离子浓度在0.1mol/L左右时萃取率较高,随着浓度进一步的提高,萃取率会发现明显的降低。反萃离子强度在2mol/L左右回收率最高,高于或低于2mol/L回收率都会有明显的降低。

2.3 AOT浓度对萃取过程的影响 根据一些文献,AOT的最佳浓度适用范围对于不同的目的产物不同,对于不同的萃取物质,AOT浓度差别较大,故在本实验中AOT的浓度范围作为一个重要因素进行考虑。AOT浓度太低达不到临界胶束浓度,不会形成反胶团,对目的产物无萃取作用,但是AOT浓度太高,会造成其在有机相中不溶解,反胶团形成浑浊溶液,多余AOT进入水相,影响实验结果,还会造成试剂浪费。而对于我们本次用的实验药品,AOT浓度在80mmol/L以上会有一部分不溶于异辛烷中,因此对于后面的正交试验,选择AOT浓度分别为50、60、70、80mmol/L。AOT浓度对萃取效率也有较大的影响。从实验数据分析得,AOT浓度在60mmol/L左右最佳。

3 结论

AOT浓度60mmol/L;以异辛烷作为有机溶剂;萃取pH为2.0;离子强度为0.1mol/L;反萃取PH为10;离子强度为1mol/L;萃取离子和反萃离子都为氯化钾;萃取时间为15min;水浴振荡250r/min;反萃时间为20min;水浴振荡250r/min;有机相:水相=1:4(V:V);有机溶剂可以循环利用;萃取温度为室温;色氨酸回收率最高可以达到70%左右。

随着人们生活水平的进一步提高,色氨酸的需求量将会逐步增大。目前,在工业生产中大多采用的还是离子交换分离技术。但是,从相关报道的数量上来看,膜分离、液膜和反胶团萃取研究较为热门。可见,新方法在操作、分离效率和能力等方面已经显现出相当的优势,相信一定会有良好的应用前景。

参考文献:

[1]窦光宇.色氨酸有益健康.家庭医学.2007(5):48.

[2]Krishna S H,Srinivas N D,Raghavarao K M,et al.Reverse micellesextraction for downstream processing of protein/enzymes.Adv Biochem Eng,2002,75:119~183.

[3]王履庆.食品营养分析实用手册.北京:中国科学技术出版社.1995.

[4]郎惠云,文辉忠,谢志海等.分析科学学报.1997.13(3):225.

[5]杜连祥等.工业微生物学实验技术[M].天津:天津科学技术出版社.1992.

[6]黄伟坤等.食品检验与分析[M].北京:中国轻工出版社.1989.

[7]KatsumataR,Ikedam.[J]Bio/Tech.1993(11):921.

[8]刘亚萍,张关永.反向微胶团萃取分离酪氨酸的研究.氨基酸和生物资源.2001.23(2):32～35.

[9]冯有胜,单振秀.细胞色素-C的亲和反胶团萃取研究.西南农业大学学报(自然科学版).2006.28(4):562～565.

[10]苑艳辉,钱和.AOT/异辛烷反胶束体系萃取豆豉纤溶酶的前萃工艺初探.河南工业大学学报(自然科学版).2006.27(2):38～42.

[11]魏玲,李学琴等.AOT(Tween80)/异辛烷反胶束体系在萃取番茄籽蛋白中的应用研究.食品科技.2008(1):73～76.

[12]于艳春,郑纯智等.AOT/异辛烷反胶团体系提取脂肪酶的研.淮海工学院学报(自然科学版).1998(9):49～50.