上海市肠炎沙门菌流行特征和分子分型研究

许学斌　袁政安　金汇明　肖文佳　顾宝柯　陈　敏　冉　陆　刁保卫　崔志刚

(1.上海市疾病预防控制中心, 上海200336;2.中国疾病预防控制中心, 北京100050）

摘要[目的]分析上海市2006—2007年的肠炎沙门菌株，了解本地区肠炎沙门菌的分子流行病学特征。[方法]回顾2002—2007年肠炎沙门菌食品株的来源并与肠炎沙门腹泻株作耐药性比较；对2006—2007年全球沙门菌监测（GSS）病例和食品分离的肠炎沙门菌进行表型验证、药敏试验和脉冲凝胶电泳（PFGE）分析。[结果]2006—2007年肠炎沙门菌在本市非伤寒沙门菌病例中列首位，而80%的食品株源自禽及禽肉制品，食品株的抗生素耐药性高于腹泻株。2007年肠炎沙门菌腹泻株的耐药谱和2006年有较大差异。包括13株食品株在内共76株肠炎菌株可分为21种PFGE带型，遗传同源性接近80%，优势带型依次为3型（34株）、1型（12株）、2型（5株）和5型（5株），除2型外均发现有与腹泻株同型的食源株。2006和2007年的PFGE1/2型病例分别为4例和12例。[结论]上海市肠炎沙门菌病例和食用污染的鸡肉等禽类制品有密切关系，PFGE3型肠炎沙门菌是目前上海市肠炎沙门流行株的优势菌型，2007年发现由鹅肝传播的1/2型肠炎沙门菌可能是3型的变异株并有取代成为流行菌株的趋势。开展对腹泻病例和食物链的综合监测和以实验室为主的实时分子分型检测能快速预警肠炎沙门菌散在爆发和追溯污染源。

［关键词］肠炎沙门菌；脉冲凝胶电泳；分子分型；爆发；污染源

Study on the epidemiological character and molecular typing of Salmonella enterica serovar Enteritidis in ShanghaiXU Xue-bin1，YUAN Zheng-an1, JIN Hui-min1，XIAO Wen-jia1,GU Bao-ke1，CHEN Min1，RAN Lu2，DIAO Bao-wei2，CUI Zhi-gang 2（1.Shangahi Center of disease Control and Prevention，Shanghai 200336，China；2.China Center of Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China）

Abstract：［Objictive］ To study the molecular epidemiological characteristics of Salmonella enterica serovar Enteritidis（S. Enteritidis）strains in Shanghai from 2006 to 2007.［Methods］ A retrospective analysis from 2002 to 2007 was performed to explore the source of food-borne S. Enteritidis strains and compare its antibiotic resistance with strains isolated from diarrhea patients.Data of S. Enteritidis strains of patient and food of Global Salm-Surv(GSS) from 2006 to 2007 were tested;including phenotype confirmation,antibiotic resistance and pulsed-field gel electrophoresis(PFGE) analysis.［Results］S. Enteritidis was the topmost strains in diarrhea patients caused by non-typhi Salmonella in 2006 to 2007,in Shanghai. 80% strains of food-borne S. Enteritidis were obtained from poultry and its meat products.The antibiotic resistance of food isolates was higher than clinical isolates. The drug resistance spectrum of diarrhea patients isolates in 2006 was different from that in 2007.76 strains including 13 food-borne strains belong to 21 PFGE pattern combinations,and their genetic similarly was higher than 80%. The major PFGE subtype was 3(34strains),1(12 strains),2(strains)and 5(strains),Every strains from food has matched PFGE subtype strains in diarrhea patients except subtype 2. The number of homology case of diarrhea patients and food caused by subtype 1/2 were 4 and 12 in 2006 and 2007.［Conclusion］ There is close relation between the diarrhea patients of S. Enteritidis and the contaminated poultry(chicken) in Shanghai.The PFGE subtype 3 is the dominant epidemic strains.The PFGE subtype 1/2 isolated from goose liver in 2007 may be the virieties of subtype 3,and they may tend to replace the dominant strains.The study suggested that rapid control and forecast the potential outbreak cases of S. Enteritidis and trace the suspected contamination source by combine the surveillance of clinical patients and food chain,including the real-time molecular typing in laboratory.

Key words：S. Enteritidis; PFGE; Molecular typing; Outbreak; Contamination source

从1995年以美国疾病预防控制中心（CDC）为主的多国、多部门合作建立的细菌分子分型国家电子网络（PulseNet）监测体系开始，由非伤寒沙门菌引发的许多公共卫生事件就被各种传媒广泛报道而影响到全球范围的相关食品贸易。作为我国经济、贸易发达地区，上海于2006年加入非伤寒沙门菌的全球监测网络（GSS），完成2年的监测发现，肠炎沙门菌（血清型）是造成本市非伤寒沙门菌的感染性腹泻病例和食源性疾病的优势菌型。为研究肠炎沙门菌在本市的爆发和流行趋势，本研究通过对肠炎沙门菌食源株的回顾性分析和对2006—2007年GSS肠炎沙门菌腹泻菌株进行抗生素耐药和脉冲凝胶电泳（PFGE）分析，以了解本市肠炎沙门菌的分子流行病学特征，为本市的非伤寒沙门菌监测和防治提供依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验菌株实验菌株有2002—2007年食源性肠炎沙门菌48株和2006—2007年GSS病例分离的肠炎沙门菌84株；药敏试验的肠炎沙门菌204株，包括2005年67株腹泻株、2006年8株体检株、2006—2007年84株GSS腹泻株和45株食品株；PFGE分析肠炎沙门菌76株，包括2006—2007年GSS监测的13株食品株和63株GSS腹泻株；大肠埃希菌ATCC25922为药敏试验质控菌株；产超广谱ß-内酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯杆菌ATCC700603；本中心菌种保藏室提供的布伦登卢普沙门菌H9812作为PFGE的分子质量标准菌株。

1.1.2培养基改良亚硒酸磺绿增菌液（MSBG）、罗伯特增菌液（RVS）、木糖赖氨酸胆酸盐琼脂平板（XLD）、CHROMagar™沙门菌显色琼脂平板（CAS）、M-H琼脂平板均购自上海科玛嘉科技有限公司，肠道双支糖综合鉴别管和其他辅助生化鉴定试剂由本中心供应室配置。以上增菌液和平板均于避光10℃以下保存，在有效期内使用。

1.1.3 试剂和仪器沙门菌分型诊断血清50种（成都生物制品研究所）、沙门菌分型诊断血清79种（S＆A，Ltd，泰国）；药敏分配器和16种抗生素纸片：四环素（TET）、头孢噻夫（EFT）、奥格门丁（AMC）、氨苄西林（AMP）、复方新诺明（SXT）、环丙沙星（CIP）、氯霉素（C）、氧氟沙星（OFX）、萘啶酸（NA）、头孢吡肟（FEP）、头孢噻肟（CTX）、甲氧苄氨嘧啶（W）、头孢他啶（CAZ）、庆大霉素（CN）、磺胺甲异恶唑（S3）、链霉素（S）（Oxoid，英国）；Etest头孢噻肟及头孢噻肟含克拉维酸纸条和11种含抗菌药物纸条（AB biodisk，瑞典）；VitekAM-60自动生化鉴定仪和菌液比浊仪（生物-梅里埃，法国）；限制性内切酶XbaⅠ（TaKaRa，日本）；SeaKem Gold琼脂糖（Cambraex Bio Rockland，美国）；脉冲凝胶电泳仪CHEF mapper system和凝胶成像系统GEL Doc2000（Bio-Rad，美国）；血清和抗生素纸片均在有效期内使用。

1.2实验方法

1.2.1食品样品非伤寒沙门菌检测根据文献方法［1］和2007年制定《上海市沙门菌病监测方案》中食品检测程序完成样品处理、分离初筛、菌株鉴定和血清分型等，生化反应符合并且血清抗原式符合［9:g,m:-］者鉴定为肠炎沙门菌。

1.2.2非伤寒沙门菌病例（GSS）监测按照文献方法［2］和《上海市沙门菌病监测方案》中粪便样品检测程序完成对样品分离、初筛鉴定和血清分型，生化反应符合并且血清抗原式符合［9:g,m:-］者鉴定为肠炎沙门菌。

1.2.3抗生素敏感性试验参照CLSI（NCCLS）2005年操作规程采用改良K-B法并根据抑菌圈直径判断敏感（S）、中介（I）、耐药（R），抑菌圈范围在中介者并入R统计值； ESBLs菌株测试以头孢噻肟作为初筛试验，抑菌圈直径≤27mm者为疑似ESBLs，确认试验使用Etest测试条检测头孢噻肟和头孢噻肟-克拉维酸复合剂，若当克拉维酸存在比无克拉维酸时的MIC降低大于4个稀释梯度可判断为产生ESBLs［3］。ESBLs菌株最低抑菌浓度（MIC）用Etest法测定11种抗生素。

1.2.4 PFGE按照GSS方案要求，在中国CDC国家肠道病重点实验室按照PulseNet规定的PFGE标准方法对76株肠炎沙门菌进行凝胶电泳、图谱分析和BioNumerics（Version 4.0）软件聚类分析。

2 结果

2.1食源性肠炎沙门菌

从食品中分离肠炎沙门菌48株，包括2002—2005年的35株和2006—2007年的13株。其中来源于鸡、鸭等禽肉制品为32株（80.0%，32/48），其次分别来源于猪、牛等畜肉制品8株、奶制品3株、豆制品2株、水果2株、蔬菜1株。

2.2GSS监测肠炎沙门菌病例

2006年从GSS病例分离到肠炎沙门菌44株（22.4%，44/196），高峰期在8月；2007年从GSS病例分离到肠炎沙门菌40株（23.7%，40/168），高峰期在8、9月间。2年中肠炎沙门菌在非伤寒沙门菌腹泻病例的血清型构成中均占首位，2年内与月度分离菌株数对应的流行趋势见图1。

2.3肠炎沙门菌抗生素耐药率

204株肠炎沙门菌分别来自腹泻病人（151株）、体检（8株）、食品（45株）。肠炎沙门菌临床株对氟喹诺酮类的氧氟沙星、环丙沙星和复方新诺明、氨苄西林、奥格门丁的耐药率低于食品株，差异有显著性（χ₂>3.8，P<0.05）；体检株对大多数抗生素全部敏感，仅对四环素、利福平、链霉素、萘啶酸存在不同程度耐药；食品株对萘啶酸、头孢噻吩的耐药低于临床株，两者差异有显著性（χ₂>3.8，P<0.05），多重耐药菌株的比例高于前两者。临床株耐药率自2007年始发生较大变化，其中对四环素、氨苄西林、磺胺甲异恶唑、链霉素的耐药率出现了较大幅度的增高，对萘定酸的耐药率则出现了下降（图2）。有2株经Etest筛选后确认为ESBLs菌株分别是2006年的临床株和食品株，对氨苄西林和第一代头孢菌素（头孢噻吩）的抑菌浓度大于256mg/ml，在第三代头孢菌素中对头孢噻肟和头孢三嗪的抑菌浓度均大于256mg/mL，仅泰能敏感。禽肉株的耐药值大于临床株（表1）。

2.476株肠炎沙门菌株的PFGE分型

76株肠炎沙门菌共分为21种带型。63株临床株分15个带型，优势带型为3型（49.2%，31/63）和1型（17.5.0%，11/63），2型和5型各5株，4型、6型和34型各2株，其他型均仅有1株。1型与2型的差异较小，同源性达98%，与3型、4型也有90%的同源性。13株食源性菌株除1株自胡萝卜、1株自猪肝分离外，其余11株有10株自鸡肉制品分离，有1株自鸭肉制品分离。食源菌株的带型分10种，和临床株能完全匹配的型别有4个带型（6株菌），分别是1型（1株）、3型（3株）、4型（1株）、5型（1株），其余6个带型（7株菌）相对独立。所有来源自病人和食品的肠炎沙门菌聚类图谱显示菌株间的遗传同源性接近80%（图3）。

3 讨论

GSS是以腹泻病例监测为基础重点针对非伤寒沙门菌引起的“散在爆发”案例开展相关的食源性溯源调查研究的全球合作项目，项目初始阶段我们对方案和设立的监测点完成对现场信息采集和实验室标准化检测流程的质量控制和初步评估，随后需要重点分析能造成“多点”或“局部”流行的个别优势血清型的分子流行病学特征［4］。肠炎沙门菌是最早发现能够引起大规模食物中毒的非伤寒沙门菌血清型之一，也是近年我国沙门菌食物中毒爆发和流行案例的主要病原。从本次GSS报告的肠炎沙门菌株月报表所绘制的流行曲线观察（图2）：2006年本市监测到的肠炎沙门菌检出数频率变化较大，高峰为12株，2007年的曲线变化小，但检出高峰在流行季节持续时间相对较长；从菌型构成分析：2005年本市监测的肠炎沙门菌株总数次于鼠伤寒沙门菌排第二位，而2006-2007年则超过鼠伤寒沙门菌排在首位，这种型别交替的现象通过2008年的GSS年度报告证实这在全球GSS网络中具有共性特征。

高度散发的肠炎沙门菌株（病例）之间的关系以及是否可能和被污染的食品之间形成潜在的食源性危险因素是本次个案研究的重要目的。基于GSS项目系统完整的菌株资源并整合本市非伤寒沙门菌血清型监测的历史数据回顾性分析48株食源性肠炎沙门菌：80%的肠炎沙门菌源于禽肉制品，特别是鸡肉制品（包括超市和农贸市场的生鲜和冷冻、定型和非定型包装产品）阳性检出率远远高于其他种类的食品。这种具有优势的统计结果至少说明在加工和销售过程中频频被污染的鸡肉制品是本市肠炎沙门菌病例的重要“媒介”，这为食品卫生监督部门如何对大型超市、集市及餐饮场所做好生鲜食品的分割或料理的安全控制管理和在企事业单位食堂或家庭宴请时强调“生熟分开”提供了科学的管理依据。

耐药表型监测在PulseNet监测中的意义具体表现在—美国食品药品监督管理局（FDA）通过收集分析食源和腹泻菌株的耐药率变迁来及时评估国内外的食品株对本国沙门菌病发病率的影响。根据我们对非伤寒沙门菌的历史耐药监测资料得到的结论，食源性沙门菌的耐药率水平多高于临床株，尤以萘啶酸和环丙沙星等喹诺酮类抗生素较显著，而临床株的耐药水平也不断呈上升趋势［5］。虽然本次肠炎沙门菌株的耐药表型也基本具有过去的一些耐药特征，但2007年肠炎沙门菌的临床株对四环素、氨苄西林、磺胺、链霉素耐药水平升高的变化趋势我们认为是菌株发生了分子水平的变异并通过表型机制表达出的“拐点效应”。相比之下，食源性肠炎菌株的耐药率仍虽远高于临床株的水平，但和既往的耐药水平相比已有一定的下降，这在某种程度上反应国家在动物饲料及农产品养殖过程中对某些抗生素滥用所采取的积极控制措施初见效果。ESBLs沙门菌在中国已有多例被发现和报道，本次筛选的2株肠炎沙门菌其产生的CTX基因酶型和公共卫生意义值得进一步的研究［6］。

PFGE图谱能阐述本地区的肠炎沙门菌分子水平的变化特征：腹泻株和食品株之间存在共性和个性的PFGE型谱特征。63株肠炎沙门菌临床株的优势型分别是3型（31/63）和1/2型（16/63），2006/2007年各有3株食品株（分别为鸡肝、鸡胸肉、猪心）与3型图谱完全匹配；2007年有1株鹅肝株与1型图谱完全匹配。其次，2006年的优势分子型为3型（15株），1型仅有4株；而2007年虽然也有16株为3型， 但1/2型则有12株，1/2型在2年中所出现型别的显著性升高说明，PFGE3型在本地区肠炎沙门菌的绝对流行株中仍占主导，但是新出现分子变异的1/2型从2007年开始有逐步替代本地优势型的流行趋势。同时该结论和流行病学特征、耐药表型分析的结果变化之间形成相互验证。本次使用限制性内切酶XbaⅠ酶切所得PFGE图谱与中国台湾学者在1998-2002年的分型结果得到PFGE3型为优势分子型的结论一致，说明肠炎沙门菌PFGE3型在过去相当长时间里其遗传特征是稳定的［7］。另比较GSS2008年度报告中广东省的分型结果显示，其2007/2008年的肠炎沙门菌的流行株亦为1/2型，和本市的分型特征一致。当然，1/2型最终能否替代3型成为本地或在更大的范围里成为流行株还需要我们继续监控和研究。

现阶段我们离WHO-GSS要求监测点对沙门菌病例进行时实监测的要求仍有较大差距。但是在2年中我们得到本市沙门菌的发病率等流行病学本底资料，大大提高监测点现场人员的信息采集和流调能力，也帮助临床实验室人员提高分离、鉴别沙门菌的能力和与现场人员的沟通能力；还初步证明禽肉制品可能是本市肠炎沙门菌病例的潜在传染源，而PFGE图谱证明鹅肝是本市2007年出现的肠炎沙门菌1/2型流行的传染源。这些现场和实验室结合的系统性研究模式为继续做好项目的研究提供了可能的条件，所积累和得到的相关信息能服务和共享于本市的公共卫生保障体系的建设和2010年世博会的卫生保障活动。

4参考文献：

［1］许学斌,顾宝柯,袁政安,等.富营养预增菌液在肉制品沙门菌常规检测方法中替代效果研究［J］.中国人兽共患病学报，2006,22(7):633-635.

［2］许学斌,顾宝柯,陈敏,等.沙门菌检测方法的优化［J］.检验医学，2007,22(6):677-680.

［3］Murray PR,Pfaller MA,Tenover FC.临床微生物手册［M］.北京:科学出版社,2005:2209-2224.

［4］顾宝柯,袁政安,金汇明,等.上海市沙门菌病流行特征分析［J］.环境与职业医学，2008,25(3):245-247.

［5］许学斌,顾宝柯,金汇明,等.免疫磁珠法检测食品中的沙门菌及分离菌株的耐药性［J］.中国食品卫生杂志.2006,18(3):202-204.

［6］Cui SH,Li JY,Sun ZY,et.al.Characterization of Salmonella enterica isolates from infants and toddlers in Wuhan,China［J］.J Anti Chem，2008:1093-1099.

［7］Pang JC,Chiu TH,Chiou CS,et.al.Pulsed-field gel electrophoresis,plasmid profiles and phage types for the human isolates of Salmonella enterica serovar Enteritidis obtained over 13 years in Taiwan［J］.J Appl Microbiol，2005,99:1472-1483.

项目基金：中美新发和再发传染病项目资助［编号：美国疾病预防控制中心（CDC）5U2GGH000018-02］

作者简介：许学斌（1972—），男，主管技师。（收稿日期：2008-12-24）