籼稻姊妹染色单体粘着蛋白OsRad21-i基因的原核表达载体构建与表达*

康海岐，申国安 , 杨金水 , 程在全

(1.中国科学院昆明植物研究所，云南 昆明 650204;2.四川省农业科学院作物研究所，四川 成都 610066；3.复旦大学遗传研究所，上海 200433)

早期曾经从杂交水稻品种汕优63的根叶抑制消减杂交(SSH)结果中鉴定出了一个EST序列，与Cohensin基因家族同源性较高,通过GeneBank查询与序列拼接,设计特异性引物，克隆出了一个长达3 230 bp的cDNA片段，测序后通过序列比对和理论预测，发现该序列酷似水稻姊妹染色单体粘着蛋白，命名为OsRad21-i基因。其中包含一个开放阅读框ORF(3 166 bp)，编码1 055个氨基酸；起始密码子之前有67 bp的5′UTR区，终止密码子之后有一段94 bp的3′UTR区。该基因由14个外显子组成，位于水稻第1号染色体上154.6～154.9 cM之间,存在于水稻基因组AP003349和 AP003418两个PAC 克隆上。OsRAD21-i蛋白的理论相对分子质量约为115 300，等电点4.41。因此在GenBank首次登录了属于Rad21、Rec8/Scc1基因家族的第一个水稻基因序列，登录号为AY318757。

进一步理论分析表明，OsRad21-i的ORF序列中具有两个保守区: N-端1-120位氨基酸序列，含有KOG1213和pfam04825功能域，属于姊妹染色单体粘着复合物Cohesin亚基RAD21/SCC1部分，为细胞分裂和染色体配对等细胞学过程中的关键成份之一。C端997-1050位的氨基酸序列，含有pfam04824功能域。pfam04825和pfam04824功能域均是RAD21/REC8类蛋白标志性功能域，代表了真核生物粘着蛋白RAD21/REC8/SCC1家族特征性保守区。其主要作用在于有丝分裂和减数分裂中介导姊妹染色单体的粘着，是粘着复合物的一部分[3-6]。文献报道了粳稻中同类基因的序列信息，但未从实验方面进行验证[7]。

为了验证上述理论推测和下一步的蛋白质实验及功能研究，本文以克隆载体pGEM-T和原核表达载体pQE30及大肠杆菌M15菌株，进行了OsRad21-i的原核表达尝试。由于理论预测的OsRAD21-i蛋白相对分子质量较大(大于100 000)，因此构建有效的表达载体将是表达目的基因之前提条件，同时也是影响表达水平及蛋白活性的重要因素。本实验通过中间载体pGEM-T，最终构建出了该基因的重组表达载体，并在M15中诱导表达出了重组蛋白OsRAD21-i，与预期结果相符，也为表达大分子蛋白积累了重要经验。

1 材料与方法

1.1 材料

LATaq.DNA聚合酶和普通TaqDNA聚合酶购自Takara公司。反转录酶、DNA限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ，及T4 DNA连接酶等购自NEB公司(New England Biolabs Ltd.，UK)。RNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司(Watson，Shanghai)。DNA Marker(DL2000,HindⅢ等)、蛋白质Marker购自大连宝生物工程公司。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。卡那霉素、氨苄青霉素、IPTG、X-gal等贮存液的配制和保存，质粒抽提试剂配制，LB、LM、SOB和SOC等大肠杆菌培养基的配制均参考文献[1]进行，其余试剂均为国产或进口分析纯。

以克隆载体pGEM-T vector作为中间载体，其宿主菌为Dh5α；pQE30为表达载体，其宿主菌为M15。M15本身含有一种低拷贝抑制质粒pREP-4，来源于pACYC质粒，能与所有质粒相容，赋予宿主菌kanr抗性，在25 μg/mL卡那霉素的选择压下则保持在E.coli菌株中。

取杂交水稻汕优63的根组织，提取总RNA，反转录为cDNA，用于目的基因克隆。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计 在OsRad21-i 的完整ORF两端设计了一对引物，上游引物Qef中引入了BamHⅠ酶切位点，下游引物Qer中引入了SalⅠ 酶切位点，引物序列如下：

Qef： 5′ -CGGGATCCATGTTCTACTCGCAGTTCATCTTGG-3′

Qer: 5′-ATCCGTCGACCTAGAAATCTGACTTCAGGAGCTT-3′

1.2.2OsRad21-i完整ORF的扩增 以汕优63根组织的cDNA为模板，以Qef和Qer为引物，按如下程序进行PCR扩增：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s, 64 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min，循环5次；94 ℃ 45 s, 62 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min，循环35次；72 ℃ 10 min。扩增出的片段命名为Eqfr。

1.2.3 表达载体构建 利用T4 DNA Ligase将Eqfr和pGEM-T vector于4 ℃下进行连接，取1 μL连接产物，稀释10倍，然后转化DH5α感受态细胞，采用蓝白斑法初筛，再进行菌落PCR筛选，确定重组子DH5α[pGEM-T-Eqfr]。提取重组克隆载体pGEM-T-Eqfr，与表达载体pQE30分别同时进行BamHⅠ和SalⅠ双酶切，电泳分离酶切后的Eqfr和线性化pQE30。

在4 ℃下按10 μL体系进行16 h酶切产物连接反应，取连接产物稀释10倍，然后转化M15感受态细胞，涂布于含Ampr和Kanr两种抗性的LB平板上，于37 ℃培养过夜。通过菌落PCR筛选目标重组子M15[pQE30-Eqfr，pREP-4]，然后提取该重组子质粒，以BamHⅠbuffer作为酶切buffer，通过BamHⅠ和SalⅠ双酶切方式进行限制性消化，酶切鉴定可表达OsRad21-i基因的重组子。

1.2.4OsRad21-i基因在E.coliM15中的诱导表达及SDS-PAGE电泳检测 挑取含重组表达质粒M15[pQE30-Eqfr，pREP-4] 的单菌落和阳性对照M15[pQE30，pREP-4]单菌落，分别接种于50 mL LB液体培养基(含100 μg/mL Amp和25 μg/mL Kan)；再将一个阴性对照M15[pREP-4]单菌落接种于50 mL LB液体培养基(仅含25 μg/mL Kan)；于37 ℃恒温摇床以240 r/min的速度振荡培养至A600达到0.3～0.6左右，一般约30 min；但诱导表达时间和温度可根据实际情况(可溶性, 稳定性和表达量)进行调整。

从以上3种培养液中各取1 mL保存于4 ℃冰箱，然后加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达2～6 h，在不同时间段分别各取1 mL培养液保存于4 ℃冰箱。

样品取完后，以6 000 r/min 离心10 min,收集菌体。加50 μL 双蒸水和50 μL 2×样品缓冲液(100 mmol/L Tris·HCl, pH8.0, 100 mmol/L DTT,w=4% SDS,w=0.2%溴酚蓝,w=20%甘油)重悬菌体，沸水中煮5 min后进行SDS-PAGE电泳。

电泳参照Lammeli[2]的方法进行，分离胶w为12%，浓缩胶w为3.9%，结束后用考马斯亮蓝R-250染色。所用试剂包括：w=30%聚丙烯酰胺母液、w=10%SDS、w=10%过硫酸铵、5×SDS电泳缓冲液、5×SDS样品缓冲液、1.5 mol/L Tris·HCl (pH8.8)、裂解buffer、染色液、脱色液等配制方法和实验步骤参考文献[1]。

2 实验结果

2.1 原核表达载体的构建与鉴定

2.1.1OsRad21 -i ORF的克隆 以Qef和Qer为引物，从汕优63根组织中扩增出了OsRad21-i的完整ORF片段，命名为Eqfr，回收并检测其浓度约为50 ng/μL。将Eqfr与pGEM-T的连接液转化E.coliDH5α感受态细胞，筛选重组子，将11、14、32、33号等克隆用于下一步实验。

2.1.2 载体pGEM-T-Eqfr和pQE30的酶切与回收 提取14、32和33号克隆的质粒，分别命名为p14、p32和p33，用BamHⅠ和SalⅠ进行限制性酶切，电泳分离后回收酶切片断，酶切p32和p33质量浓度均约为100 ng/μL。而p14酶切不完全,后续实验采用p32和p33作为目标表达基因的供体质粒。pQE30被酶切成为线性化载体，电泳检测其质量浓度约为100 ng/μL。

2.1.3 目标片断与表达载体的连接 于4 ℃进行酶切产物连接反应16 h，体系构成如下。

1 μL T4 DNA Ligase，1μL 10×Ligation buffer，2 μL酶切pQE30[102ng.μL-1]，酶切p32[102ng.μL-1]和酶切p33[102ng.μL-1]分别各6 μL，总体积10 μL。含p32片段的克隆编号为1n1-1n5，含p33片段的克隆编号为2n1-2n5。

2.1.4 含重组表达载体的克隆筛选 从LB(Ampr+Kanr)平板上获得了编号为：1n1、1n2、1n3、1n4、1n5、2n1、2n2、2n3、2n4、2n5的M15[pQE30-Eqfr，pREP-4]重组克隆，连同对照M15[pQE30，pREP-4]一起提取其质粒，PCR进行鉴定(图略)。选取编号为1n1、1n4、2n2、2n3的M15[pQE30-Eqfr，pREP-4]菌株抽提质粒，分别命名为：p1n1，p1n4，p2n2，p2n3和pQE30，测其浓度分别约为：20 ng/μL、100 ng/μL、80 ng/μL、50 ng/μL和30 ng/μL。

2.1.5 M15[pQE30-Eqfr]菌株重组质粒的双酶切鉴定 将p1n1、p1n4、p2n2、p2n3以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ于37 ℃水浴中酶切过夜，结果如图1。预期分析对照质粒ck(pQE30+pREP-4)应该被BamHⅠ和SalⅠ切成3条带，包括3 461 bp(pQE30)、2 502 bp(pREP-4)和1 238 bp(pREP-4)；3个重组质粒的转化子质粒应该被切成4条带，即除了对照质粒的3条带外，还应包括一个3 166 bp (OsRad21-i)带。图1a中，p1n1和p2n3被完全酶切，p2n3的酶切带型符合预期，电泳分离p1n1的酶切产物未完全分开；p1n4和p2n2有少量质粒未酶切完全外，其酶切带型符合预期结果。因此表明这4个质粒的酶切带型基本符合预期结果，但酶切体系需要进一步优化。

重新优化酶切体系(表1)，对质粒p1n1,p1n4,p2n2以及对照质粒ck(pQE30+pREP-4)进行双酶切试验，结果如图1b。p1n1已经基本酶切完全；除少量未完全酶切外(即6.6 kb带)，p1n4和p2n2大部分已经酶切完全；3个重组质粒和对照质粒的酶切带型与预期带型一致，结果正确。表明p1n1、p1n4、p2n2中含有正确的重组pQE30-Eqfr表达质粒,而且保持了原M15菌株中的拟制质粒pREP-4。

表1 质粒p1n1、p1n4、p2n3、p2n4以及ck的双酶切体系

图1 M15[pQE30-Eqfr, pREP-4]菌株1n1、1n4、2n2和2n3中双质粒双酶切及体系优化结果

2.2 OsRad21-i基因在M15中的表达

以M15[pREP-4]为阴性对照，以M15[pQE30，pREP-4]为阳性对照，对重组克隆M15[pQE30-Eqfr，pREP-4]菌株进行IPTG诱导表达4 h，培养液中出现了相对分子质量约为116 000的重组蛋白，而阴性对照和阳性对照中均无相应蛋白出现(图2)。说明OsRad21-i基因在M15中得到了异源表达。进一步观察该重组克隆在不同时间段的表达情况，发现当加入IPTG后0.5 h就有重组蛋白出现，但表达量较低，而后1～3 h表达量较高，4 h后表达量开始下降(图3)。

3 讨 论

3.1 OsRad21-i基因表达载体的酶切鉴定

本文构建的表达载体中，OsRad21-i基因ORF虽与载体大小相近，均在3 kb以上，但重组表达质粒在宿主细胞中可以稳定存在。对p1n1、p1n4、p2n2的2次双质粒双酶切试验表明,质粒质量数对酶切效果有较大影响，确定合适的量有利于完全酶切和结果确证。在BamHⅠ和SalⅠ各0.5 μL的情况下(相当于各10个活力单位酶量),37 ℃酶切过夜(16 h)可完全消化50 ng p1n1和120 ng ck的质粒DNA, 250 ng p1n4和160 ng p2n2则未被完全消化。可见50～100 ng质粒在37 ℃、16 h条件下可以被完全消化，若多于100 ng,除酶切不完全外,还可能出现非特异性切割。

图2 重组克隆M15[pQE30-Eqfr, pREP-4]与对照M15 [pREP-4]及M15[pQE30, pREP-4]的诱导表达

图3 重组克隆M15[pQE30-Eqfr, pREP-4]在不同时间段的表达

3.2 重组OsRAD21-i蛋白的原核表达

本文结果表明，OsRad21-i基因能够以pQE30载体在大肠杆菌M15菌株中异源表达。预测OsRAD21-i的蛋白相对分子质量为115 300，加上6×His的相对分子质量约600,与实验检测的重组蛋白相对分子质量基本一致。另外，该基因在M15中的表达具有时效性特点，在1～3 h里表达量较高，4 h后重组蛋白表达量开始下降。这可能是目的基因在宿主细胞体内过分表达对宿主造成了显著影响，引起了相关的细胞应答反应以致影响重组蛋白的稳定性，导致了重组蛋白开始被降解。因此，后续实验需要对该表达体系进行优化。可以考虑对目的蛋白进行修饰，转变为胞内不溶性蛋白质，如包涵体，或选用带有温度敏感型突变菌体作为宿主菌，或者借助于融合(标签)表达、亚细胞靶向定位等来提高表达有效性、可溶性和稳定性等问题。另外，也可以考虑发酵条件优化，比如诱导物浓度，诱导温度、时间及A600值等，培养基类型及其组分，培养温度和时间等。

参考文献：

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