葫芦科蔬菜花药培养研究进展

周　林　韩金星　黄金艳　覃斯华　李文信　洪日新　何　毅　李天艳　樊学军

摘要：概述了当前国内外葫芦科蔬菜花药培养过程中的主要影响因素，总结了单倍体植株的倍性鉴定方法与染色体加倍技术，探讨了目前存在的问题以及今后的发展方向。

关键词：葫芦科蔬菜；花药培养；单倍体；倍性鉴定；加倍

葫芦科(Cucurbitaccac)蔬菜在我国常见的主要包括西瓜、甜瓜、苦瓜、黄瓜、西葫芦等，栽培面积大，且具有较高的经济效益，在百姓日常生活中具有重要作用。但由于我国地域辽阔，气候因素和地理环境因素等生态因子限制了优良品种优良特性的发挥，通过简单的引种已经不能适应各地生产的需要。而通过常规育种手段进行品种改良又存在周期比较长、难度大、遗传性状不稳定等诸多问题，因此利用生物技术手段育种则是另一条重要途径。葫芦科蔬菜的花药培养技术不仅能够缩短育种过程中选择及纯化的时间，而且对遗传育种具有重要的理论和实际意义。

利用葫芦科蔬菜花药培养的历史可追溯到1971年西贞夫等对黄瓜花药培养进行的研究，他们获得了不定芽。在随后的几十年里，研究者们在葫芦科蔬菜9个属中的南瓜属、葫芦属、西瓜属、甜瓜属和苦瓜属等5个属获得了单倍体。

1影响葫芦科蔬菜花药培养的主要因素

影响花药培养的因素很多，涉及到供体植株的基因型、小孢子发育时期等内部因素和培养基成分、激素、碳源以及培养条件等外部因素，并且这些因素之间还存在着一定的互作效应。

1.1材料

1.1.1基因型材料基因型对花药培养的影响主要表现在对胚状体诱导率的不同上，即使在同一种内，同一方法、不同材料间有显著的差别。在葫芦科蔬菜中，研究者就此对西瓜、甜瓜、黄瓜等进行了不同程度的研究，其中以西瓜花药培养技术较为成功，前人研究较多，认为不同品种基因型之间愈伤组织诱导率相差很大，选择适合诱导品种是培养成功的关键。在李娟等的试验中发现，野生品种和栽培品种的愈伤组织诱导率有显著差别，前者要高于后者。另有研究表明，F1代在花药培养中的愈伤组织产量高于或至少等于其高产量亲本，有个别组合的F1代愈伤组织产量甚至成倍地高于其高产量亲本，表现杂种优势。在缑艳霞的西瓜花药培养试验和董艳荣的甜瓜花药培养试验中对此也进行了证明，

1.1.2小孢子发育时期小孢子细胞发育时期一般分为四分体时期、小孢子时期(单核早期、单核中期、单核靠边期、双核期)和成熟花粉粒时期。不同植物花药培养最适宜的小孢子发育时期不同，而最适发育时期是影响诱导效果的关键。有研究表明，南瓜小孢子单核中期和单核晚期效果较好，接种在MS+15％蔗糖+5mg/L 2，4-D的培养基上能够诱导出具分化能力的愈伤组织。另有文献指出，甜瓜花药培养最佳时期是单核靠边期到双核期，黄瓜以单核中后期的小孢子为佳，总体来说，大部分集中在小孢子时期，即单核早期到双核期，通常以外部形态指标如花辦长/花药长或花蕾长度作为此期的标准。

1.2培养基成分

1.2.1基本培养基花药培养常用培养基有MS、Nitsch、White和N₆等，培养基的成分、种类、浓度不同，都会影响花药培养的效果，以MS培养基的使用最为普遍。薛光荣袁万良、魏瑛等在西瓜花药培养中都用MS作为基本培养基，且效果较好。陈佳在苦瓜花药培养中比较了MS、N₆3N种基本培养基，发现L培养基不适合苦瓜花药愈伤组织的诱导。

1.2.2碳源糖是培养基内的碳源，起到为细胞的呼吸代谢提供底物与能源和调节渗透压的作用，糖的类型和浓度影响着胚胎形成，蔗糖作为众多碳源类型中在葫芦科花药培养使用较多且效果较好的碳源，适宜浓度为3％～6％。蔗糖经高压灭菌后分解为果糖和葡萄糖，因此也常作为碳源另外添加，麦芽糖等其他碳源已用于小麦作物的花药培养中，但在葫芦科蔬菜花药培养上应用还不多，陈佳在苦瓜花药培养中对培养基添加麦芽糖进行了试验，认为其所诱导出的愈伤组织胚性高低需进一步研究。

1.2.3激素激素对花药培养中诱导花药胚状体的发生起到了关键作用，主要包括了生长素和细胞分裂素，前者常用的包括2.4-D，IAA，NAA等，后者常用的包括KT和6-BA等。一般来说，低质量浓度的生长素可以提高胚状体的诱导率，其中2，4-D在西瓜愈伤组织诱导过程中不宜超过0.5mg/L，否则易产生没有分化能力的疏松愈伤组织；而低质量浓度2.4-D(0.4 mg/L)可以使甜瓜花药愈伤组织内部产生细胞核较大的胚性细胞、二细胞团和多细胞结构。同时，6-BA与生长素的配合使用也起到了关键作用。对愈伤组织和胚状体的分化，6-BA也起到了重要的作用，配合适当质量浓度的IAA可分化出小植株。

1.2.4其他添加成分活性炭(AC)常被作为防止褐化的抗氧化剂物质添加到花药培养基中，在有关辣椒花药培养中，有试验表明添加0.5％的活性炭是有益的。而在葫芦科蔬菜上，喻财铃和缑艳霞分别在丝瓜和西瓜的试验中发现加入活性炭的效果差，有抑制作用。

大多数研究认为，硝酸银作为乙烯抑制剂，在组织及细胞培养中能够促进胚性愈伤组织的形成；也有人认为它能促进多胺的合成以提高胚性愈伤组织的形成，进而提高愈伤组织分化频率。在小麦花药愈伤组织分化培养基中加入硝酸银有利于提高愈伤组织分化率和绿苗率，可提高小麦花药培养效率。在葫芦科蔬菜的花药培养中应用硝酸银少见报道，曹利仙等发现黄瓜离体子叶培养中添加2～6 mg/L硝酸银能显著提高子叶芽的再生频率，韩丽华将硝酸银应用于厚皮甜瓜未受精胚珠的离体培养上，发现对诱导单倍体再生植株有一定的作用。

三十烷醇作为外源添加剂最先在袁万良等报道的西瓜花药培养中使用，发现可以提高绿色愈伤组织的诱导率，并形成深绿色点状组织，提高了再生植株的诱导率。随后在李娟等的西瓜花药培养试验研究中也发现三十烷醇有此作用，但在缑艳霞和王开冻等的西瓜花药培养试验研究中发现三十烷醇只对诱导和保持绿色愈伤组织有利，对促进不定芽形成作用不明显，而三十烷醇在其他葫芦科蔬菜上的应用尚未见报道。

1.3培养方法

1.3.1预处理花药或花粉经过预处理后再进行培养是花药培养中比较常见的培养方法，其中包括低温、高温、热激以及离心。大部分葫芦科蔬菜花药培养采用低温对花药进行预处理，其作用是：第1，引起花药内源激素发生变化，进而影响愈伤组织的形成；第2，引起小孢子的孤立化，使花药壁细胞和绒毡层在低温预处理过程中退化解体：第3，减缓小孢子退化，保持生活力，使更多的小孢子有机会参与雄核发育。魏瑛的研究表明西瓜花药在4℃下低温处理72 h效果较佳：Ashok Kumar等将黄瓜花蕾在4、32℃下分别处理1～10d、1d，结果表明在4℃下处理2d的效果最佳。

1.3.2培养温度及光照花药培养中，培养温度和光照

对愈伤组织或胚状体的形成以及促进其生长都有重要作用。大部分葫芦科蔬菜花药培养的温度为25～28℃，在西瓜花药培养中，缑艳霞尝试了将花药在30℃下高温预处理72 h后置于25℃低温下，发现也能提高愈伤组织的诱导率。先黑暗培养后光照培养，也能促进优良愈伤组织的诱导。这在甜瓜、丝瓜上都得到了验证。

2葫芦科蔬菜单倍体倍性鉴定及加倍技术

通过花药培养途径再生的植株，往往会受到花药壁、绒毡层组织等的影响产生单倍体、二倍体及其他倍性植株的混合群体。因此，有效的倍性鉴定是了解其遗传背景和进一步应用的基础。目前的倍性鉴定方法主要有直接鉴定法和间接鉴定法。

2.1直接鉴定法

直接鉴定法即染色体计数方法，这是确定倍性最基本和最精确的方法，传统采用根尖、卷须、叶片愈伤组织为材料，常采用压片法和去壁低渗法进行染色体标本制备。其中压片法先在对二氯甲苯或8－羟基喹啉水溶液预处理，使中期染色体缩短。再用卡诺固定液固定1～2h，最后以醋酸洋红或铁矾苏木精作为染色剂，观察细胞中期染色体并计数。在鉴定单倍体根尖细胞染色体数目时，由于单倍体植株根尖具有二倍化的倾向，也就是细胞中染色体组可能自然加倍，因此仅进行根尖分析，还不能为植物的染色体提供可靠的证据，应辅助根尖以外的细胞如嫩叶细胞、花粉母细胞等的染色体观察也是必要的，这样可以排除嵌合体的干扰。去壁低渗法是陈瑞阳在国内首创的染色体标本制备方法，该方法既可用于染色体计数，还可用于染色体组型分析Gimsa分带等研究，并可借助扫描电镜对植物染色体进行观察。

2.2间接鉴定法

间接鉴定法主要包括外部形态指标鉴定、叶片气孔保卫细胞数目鉴定以及流式细胞仪鉴定法。杜胜利等通过研究比较黄瓜辐射花粉授粉产生的再生植株中的二倍体和单倍体，发现单倍体植株较之二倍体植株具有叶片小、花辦裂片深、长势弱等特点。且不能正常结籽，雄花败育，雌雄花花冠明显深裂，可以作为区分黄瓜单倍体和二倍体植株的形态指标。在显微镜下观察叶片气孔保卫细胞的长度，是近年来采用较多的倍性鉴定方法，通过卡方适应性测定表明，气孔保卫细胞长度在单倍体与二倍体之间存在着真实差异。Sail等在西瓜、Norio和马国斌等在甜瓜上均发现叶片气孔保卫细胞叶绿体个数与植物倍性呈正相关，可以作为鉴定西瓜、甜瓜倍性的间接方法。流式细胞仪通过测定处于分裂间期细胞DNA含量，从而确定细胞的倍性，是一种快速的鉴定方法。且不受取样部位和时间限制，对样品的需要量少，适合大量样本检测使用，但检测成本较高，应用范围有限。

2.3染色体加倍技术

利用离体培养过程中染色体自然加倍现象得到二倍体纯合植株是目前花药培养育种最为常见的加倍方法，但受到多种因素影响。其中物种的影响最大，如自然加倍率水稻花药培养为70％，烟草花药培养几乎为0，小麦花药培养在20％～30％。而葫芦科蔬菜花药培养再生植株自然加倍率也很低，仅在西瓜上有过报道。有研究表明花药培养再生植株自然加倍主要是通过核内有丝分裂进行，这和接种花药的发育时期，培养基中激素的种类和水平，花粉植株的发生方式以及愈伤组织继代培养时间的长短有关系。

染色体人工加倍最有效的方法是采用药剂处理，常用药剂除了秋水仙素，还有一些有机杀菌药剂。通常使用秋水仙素0.1％～0.5％溶液处理离体培养的单倍体植株腋芽、顶芽或整个植株。Sail等用0.5％秋水仙碱浸泡单倍体幼苗生长点也成功地使西瓜单倍体加倍得到双单倍体植株。

3问题与展望

就目前而言，大部分葫芦科蔬菜花药培养的研究主要集中在西瓜、甜瓜、黄瓜3个种类上，而对南瓜、苦瓜等其他物种研究较少。在多数葫芦科蔬菜花药培养获得的再生植株是通过愈伤组织途径得到的，而细胞愈伤化后极不稳定，容易产生多倍体和非整倍体。并且花药愈伤组织可能来自小孢子，也有可能来自花药壁等体细胞，在愈伤组织阶段很难鉴别其倍性。另外在花药培养离体再生的过程中，由于受到各种内、外部因素的影响，愈伤组织容易褐化、分化难、芽伸长缓慢、再生频率低，并且再生体系重复性差。而通过胚状体途径得到的再生植株可以减少来自花药壁等体细胞的再生植株，同时胚状体的成苗率和再生植株的成活率都比较高，并且能自然加倍成为二倍体纯合植株。因此，深入研究小孢子脱分化启动与胚状体的发生机理和诱导条件是从胚状体途径提高葫芦科蔬菜花药培养诱导率的关键。葫芦科蔬菜的自然加倍率较低，而通过秋水仙素处理的人工加倍，整体加倍效率不高，且易产生多倍体，人为控制的因素和方法需要进一步的探讨。虽然对葫芦科蔬菜花药培养的研究已取得了一定的进展，但存在的问题还很多。在今后的研究中，高频再生体系的建立和成熟的加倍技术仍是我们研究的重点，从而在此基础上达到创制新的种质资源，提高葫芦科蔬菜育种水平的目的。