植物功能基因组的主要研究方法及其应用

王　丹　杨　宇

摘要概述了植物基因功能的主要研究方法，并论述了主要技术如cDNA微阵列与基因芯片技术、反向遗传学技术、表达序列标签(EST)、蛋白质组学、生物信息学等及其应用。

关键词植物功能基因组；方法；应用

中图分类号Q943文献标识码B文章编号 1007-5739(2009)01-0277-02

基因组学(genomics)指对所有基因进行基因组作图、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学[1，2]。许多生物全基因组的破译，使基因组学的研究有了一次质的突破：从结构基因组学开始过渡到功能基因组学。结构基因组学(structural genomics)是通过基因作图、核苷酸序列分析以确定基因组成、基因定位的一门科学。功能基因组学(functional genomics)代表基因组分析的新阶段，被称为后基因组学(post genomics)，旨在利用结构基因组学丰富的信息资源，应用高通量、大规模的实验分析方法，结合统计和计算机分析来研究基因的表达、调控与功能，基因间、基因与蛋白质、蛋白质与底物、蛋白质与蛋白质之间的相互作用以及生物的生长、发育等规律[3]。

传统的遗传学的方法已不能适应现在基因组学的发展，cDNA微阵列(cDNA micro-array)和基因芯片(gene chip)法、反向遗传学、表达序列标签(expressed sequence Tag，EST)、蛋白质组学、生物信息学等方法相继诞生，为基因组学的研究奠定了坚实的基础。

1cDNA微阵列与基因芯片法

cDNA微阵列和基因芯片都是基于Reverse Northern杂交以检测基因表达差异的技术。二者的基本原理是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术，在固相支持物上固定成千上万个cDNA、EST或基因特异的寡核苷酸探针，并与放射性同位素或荧光标记的靶DNA进行杂交，然后用相应的检测系统进行检测，根据杂交信号强弱及探针的位置和序列，即可确定靶DNA的表达情况以及突变和多态性的存在。该技术优点在于可以同时对大量基因，甚至整个基因组基因的表达差异进行对比分析。

1.1基因表达水平的检测及表达图谱的构建

基因芯片技术可以清楚地直接快速定量检测出细胞内几个拷贝到几个数量级拷贝的转录产物，而且还可以检测出外界因素诱导下基因表达水平变化[4]。由于微阵列技术可以同时在同一水平下大规模地、定量地检测，因而可以检测出目的基因在不同器官中的表达差异，也能检测出同一器官在不同时期的表达差异，并在此基础上绘制相关的表达图谱，以找出基因型和表现型之间的关系，有助于全面了解基因的表达状况[5]。

1.2功能相关基因的检测及新基因的发现

通过对受检样品表达图谱的成对比较，可以建立性状与基因的可能联系，鉴别目标性状基因；也可识别特定生理或代谢途径中相互作用的相关基因群。构建cDNA文库，对野生型和突变体的植株进行杂交筛选，发现其差异表达序列后，从文库中找出相应的克隆，以判断它是否是新的基因[6]。

1.3转基因的检测

采用基因芯片技术对转基因作物中常见的启动子、终止子和选择标记基因等多个外源基因进行检测，可以建立快速、准确的转基因作物筛选鉴定技术，可实现对DNA的准确、快速、大信息量的检测。

2反向遗传学(reverse genetics)

传统的遗传学或称为正向遗传学(forward genetics)主要研究自发或诱变突变体中某一突变性状的遗传行为。而反向遗传学(reverse genetics)是相对正向遗传学而言的，是在基因功能序列已知的基础上分析研究基因功能，一般通过创造功能丧失突变体来研究突变所造成的表型效应，并推测在生物体内基因的作用。

2.1基因陷阱(Gene trap)

基因陷阱是新近发展起来的一种反向遗传学方法，它主要依靠报道基因的随机插入来产生融合转录物或融合蛋白，通过检测报道基因而推知基因及其功能。目前已发展了3种不同的陷阱系统，即增强子陷阱、启动子陷阱和基因陷阱。它们之间最大的不同体现在报道基因重组体的组成和所插入基因组的位置上。基因陷阱的优势在于它只在表达水平上定位基因，细胞基因本身的转录和表达不受影响，所以可检测功能上多余的基因，也可检测在基因表达多个水平上都有作用的基因，或低水平表达的重要基因，而以前的功能基因组学的方法对这些基因都是无法确定的。

2.2TILLING技术

TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)即定向诱变基因组局部突变技术，其基本原理是：诱变实验对象并提取DNA，把多个待测样品的DNA混合在一起进行PCR，通过变性和复性过程得到异源双链。如果样品发生突变，那么形成的异源双链中必定含有错配碱基。利用特异性的内切核酸酶识别携带了错配碱基的异源双链，并在错配处切开双链，最后进行电泳检测试验结果。TILLING作为一种全新的反向遗传学研究方法已经用于多种植物及作物中，如拟南芥、玉米、水稻等。以美国为首的北美实验室借助TILLING技术，联合启动了拟南芥菜TILLING项目，直接推动了拟南芥功能基因组学项目的建立。该项目在立项的第1年就为拟南芥研究者们提供了超过100个基因上的1 000多个突变位点。随着各种生物基因组计划的深入研究，相信TILLING技术将会得到更加广泛的应用。

2.3RNA干涉技术(RNAi)

RNA干涉是指细胞内的RNAi被内、外源双链RNA(dsRNA)激活，高度特异地抑制同源基因表达的现象，是真菌、动物、植物等大多数真核生物中普遍存在的一种防御反应。RNAi已成功地应用于单个基因和基因家族中的多个成员的沉默，植物中运用转基因所形成的RNAi可以遗传到下一代，产生基因表达效应较低的转基因植物，导致植物表现出相应的缺失表型。因此，RNAi技术具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低的突变体，已成为功能基因组学的一种强有力的研究工具。

3表达序列标签(EST)

表达序列标签(EST)是指从不同组织来源的cDNA文库中随机挑取克隆，对其进行大规模测序所获得的部分cDNA的5′或３′ 序列，一个EST对应于某一种mRNA的cDNA克隆的一段序列，长度一般为300～500bp。近几年来，EST已经成为分离与克隆新基因及基因功能研究的一个行之有效的手段。然而只有少数模式植物测定了基因组序列，在大基因组的植物无法进行全序列测定的情况下，EST已经成为一种进行基因序列比较，发现和鉴定表达基因的最快的途径[7]。由于EST代表着一段表达的基因序列，可与公共数据库中的基因进行“电子杂交”(electric hybridization)，进而可以从理论上推测其所代表的基因的功能，因此可部分替代基因组成为科学研究的资源或作为全基因组研究的补充[8，9]。功能基因在进化过程中具有保守性，根据序列同源性可由数据库中大量已知EST的功能来推测未知EST的功能。

4蛋白质组学(Proteomics)

蛋白质组学表示基因组编码的蛋白质的全部集合。基因表达的产物是蛋白质，但基因和蛋白质之间也不是一一对应的关系，蛋白质翻译后还要经过修饰、加工、细胞定位或与其他蛋白质相互作用才具有生物功能，因而随着后基因组学时代的到来，对蛋白质功能的研究必将会从对特定蛋白质的研究上升到对生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式的研究，即蛋白质组学的研究。近几年来，蛋白质芯片技术(protein chip)的出现给蛋白质组学研究带来了新思路。这种技术在体外条件下进行操作，并直接检测目标蛋白质，不需要酵母作为中介，突破了酵母双杂交系统技术的局限性，因此必将成为全新的研究蛋白质相互作用的理想工具。

5展望

综上所述，植物功能基因组学已经取得了一定进展，上述研究方法也只是功能基因组学研究中的一部分，各种方法都各有侧重点也有各自的优缺点，可以相互辅助。基因组研究的深入和国际合作的加强，现有的研究手段将会不断完善和加强，也将会不断研发出新的研究技术，数据库系统也将会更趋丰富和共享度会更高，最终研究清楚植物基因组的结构及功能。目前利用功能基因组学的方法进行植物体发育过程中基因功能的研究，植物体内致病基因和程序性死亡有关基因的研究等还很少，这也为植物功能基因组的研究提供了更为广阔的应用空间。相信植物功能基因组研究方法的应用将会大大促进疾病治疗的研究，植物抗病毒研究的发展，也相信植物功能基因组研究方法在各研究领域的广泛应用将为其转化成生产力打下坚实的基础，为农业发展做出更大的贡献。

6参考文献

[1] 师科荣，王爱国.功能基因组学的研究方法][J].生物技术通讯，2002，13(4)：301-304.

[2] 李伟，印莉萍.基因组学相关概念及其研究进展[J].生物学通报，2000，35(11)：1-3.

[3] 庄金秋，贾杏林.功能基因组学研究进展[J].动物医学进展，2004，25(4)：32-36.

[4] 于玲，王莱，牛吉山，等.植物功能基因组研究进展[J].西北师范大学学报(自然科学版)，2003(39)：104-116.

[5] 樊金娟，赵开军，徐正进.cDNA微阵列技术在植物功能基因组学研究中的应用[J].生物技术通报，2004(3)：26-29.

[6] 张胜，冯志敏.基因芯片技术及其应用[J].河南科技，2005(5)：26-27.

[7] 张勇.植物功能基因组学研究[J].河西学院学报，2005，21(2)：36-39.

[8] 许占友，常汝镇，邱丽娟，等.大豆表达序列标记(EST)研究进展[J].大豆科学，2000，19(2)：165-173.

[9] 王泽亮，林善枝，张志毅，等.植物功能基因组学研究技术及其在林木中的应用[J].植物生理学通讯，2005，41(4):413-418.