大白菜ＰＨＫ４基因ｃＤＮＡ３′端序列的克隆及分析

任相亮　梁　丹　李　丹等

摘要采用3′RACEcDNA末端扩增技术，克隆出大白菜PHK4基因3′端cDNA序列。该序列长810bp，其中编码区序列546bp，编码181个氨基酸，其编码序列、氨基酸序列与拟南芥AHK4基因的同源性分别为90%和96%，说明PHK4基因与AHK4基因编码区的同源性较高，而PHK4基因3′UTR区与AHK4基因3′UTR区的同源性为52%，远低于编码区。

关键词大白菜；PHK4基因；3′RACE；克隆

中图分类号Q785文献标识码A文章编号1007-5739（2009）01-0007-02

植物在生长发育过程中有多种复杂的信号系统来识别并应答外界环境刺激，蛋白磷酸化和去磷酸化是调节细胞内信号转导的最重要的机制，这一过程由蛋白激酶催化。根据磷酸化依赖底物的特异性不同，可将蛋白激酶分为：丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶和组氨酸激酶[1，2]。典型的双组分信号系统是由组氨酸蛋白激酶和反应调节蛋白组成，当组氨酸激酶以某种方式感应到环境刺激后，其组氨酸残基自身磷酸化，并将磷酸基团转移到反应调节蛋白的天冬氨酸残基上，进而引起下游的信号级联反应来适应环境变化[3，4]。

细胞分裂素的信号转导是通过双组分信号系统进行的。在拟南芥中，该信号系统由感受细胞分裂素的杂合型组氨酸激酶型受体、磷酸转移蛋白和应答调控蛋白组成[4]。目前已确认的拟南芥中的细胞分裂素受体有3个：AHK2、AHK3和AHK4，其中AHK4主要在根中表达，该基因突变后，植株会失去细胞分裂素对根伸长的抑制作用[5，6]，从而影响植物的正常生长。

大白菜因其营养丰富、种植简便、产量高等特点，成为广泛栽培且受人们喜爱的蔬菜之一。为了研究大白菜中细胞分裂素的信号转导途径的特点，笔者拟首先扩增出大白菜中与AHK4基因同源的细胞分裂素受体基因PHK4 （Pekinensis Histidine Kinase 4）的cDNA序列。RACE技术即快速cDNA末端扩增技术（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE），它利用PCR技术，由已知的cDNA序列扩增出完整、真实的cDNA5′和3′末端序列，该方法也被称为锚定PCR或单边PCR[7]。目前，RACE技术正逐步取代经典的cDNA文库筛选技术，已成为获得全长cDNA序列的一种重要手段[8]。本研究以本课题组从大白菜中克隆得到的一段PHK4基因的cDNA序列为基础，利用3′RACE技术对该基因3′端未知序列进行扩增，获得了大白菜PHK4基因的3′端真实序列，从而为进一步研究该基因的功能和应用奠定基础。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1材料。大白菜AB-81。

1.1.2试剂。Trizol试剂购自上海英骏生物技术有限公司；dNTP Mixture，PrimeScriptTM Reverse Transcriptase，RNArase Inhibitor，琼脂糖凝胶回收试剂盒，pMD19-T载体均购自TaKaRa公司。

1.1.3引物设计。参照AMBION公司的RACE试剂盒说明书，合成3′RACE Adaptor. Adaptor1和Adaptor2（见表1）；根据大白菜一段PHK4基因的cDNA序列设计特异性引物SP1和SP2，所有引物均在上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2试验方法

1.2.1总RNA的提取。利用Trizol试剂一步法提取大白菜总RNA[9]。

1.2.2反转录合成cDNA。在200μLPCR管中加入大白菜RNA 6μL（50ng），3′RACE Adaptor 2μL（20μM），dNTP Mixture（10mM）1μL，加RNase Free H2O至10μL，混匀后70℃保温15min，迅速在冰上冷却2min；加5×Prime ScriptTM Buffer 4μL、RNArase Inhibitor（40U/μL）0.5μL，Prime ScriptTM Reverse Tran scriptase（200U/μL）0.5μL，加RNase Free H2O至20μL，混匀后42℃保温1h；70℃处理15min，冰上冷却，得到大白菜cDNA。

1.2.33′RACE扩增。按照AMBION RACE cDNA Ampli-fica tion Kit说明书操作步骤进行。先以Adaptor1和SP1为引物，进行第1轮PCR反应；再以Adaptor2和SP2为引物，进行第2轮PCR反应。

1.2.4PCR产物回收和测序。PCR扩增产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后，连接到pMD19-T载体上，提交上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.5分析方法。用NCBI和MEGA软件对核酸和氨基酸序列进行同源性分析，RNAdraw生物学软件分析预测3′UTR的二级结构[10-12]。

2结果与分析

2.13′ACE扩增

用Trizol法提取大白菜总RNA，电泳结果如图1所示。以大白菜的cDNA为模板，Adaptor1和SP1为引物，进行第1轮PCR反应；以第2轮PCR扩增产物为模板，Adaptor2和SP2为引物，进行第2轮PCR反应（如图2），在800bp左右有1条特异性的条带。将目的片段回收后，连接到pMD19-T载体上进行序列测定。

2.2大白菜PHK43′端编码序列分析

将得到的序列去掉3′RACE Adaptor后，得到810bp的片段，用NCBI预测该序列的编码区为546bp，编码181个氨基酸。在NCBI数据库中进行序列比对和构建系统树表明（如图3），与拟南芥AHK4基因的同源性最高，编码区序列的同源性为90%，氨基酸序列的同源性为96%。由结果表明，可确定所得到的序列是PHK4基因的3′端序列。

2.3大白菜PHK4基因与拟南芥AHK4基因3′UTR区比较

将得到的大白菜PHK4基因的3′UTR区序列与拟南芥AHK4基因的3′UTR区序列比对，此二者的同源性仅为52%，远远低于编码区核酸序列的同源性。大白菜PHK4基因和拟南芥AHK4基因3′UTR区的二级结构（如图4）的预测图看出，二者虽然有相似的地方，但大白菜3′UTR区的茎环结构的数量明显少于拟南芥，这可能会影响mRNA的稳定性，从而在所属植物中实施不同的调控策略[11]。

3结论与讨论

在大多数情况下，一个新基因全长cDNA序列的获得一般通过筛选cDNA文库或RACE法。本研究利用实验室已得到的大白菜PHK4基因的一段cDNA编码序列设计引物，利用3′RACE方法克隆出大白菜PHK4基因cDNA3′末端序列。分析表明，该基因与拟南芥AHK4基因的核酸序列的同源性为90%，氨基酸序列的同源性为96%。因此，可利用这种同源性，参考拟南芥基因的序列信息设计引物，克隆出大白菜PHK4基因的片段，再结合RACE技术得到基因的全长序列。

3′UTR对mRNA表达的调控作用极其重要，它不仅能调控mRNA在体内的稳定性及降解速率，控制其利用效率，协助辨认特殊密码子，而且还决定mRNA的翻译位点及控制其翻译效率[13]。从大白菜PHK4基因的3′UTR区的茎环结构的数量明显少于拟南芥，而茎环结构与mRNA的稳定性有关，这会抑制特殊蛋白质的结合，进而影响转录后积累及翻译位点的识别[14]。本研究利用3′RACE技术，扩增出大白菜PHK4基因的3′端序列，为以后研究该基因结构与功能的关系打下基础。

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