高羊茅再生体系及其遗传转化研究进展

杨　扬　何胜江　吴　凯　李兴美　付婷婷

摘要高羊茅在我国有着广泛的种植面积，是多年生冷季型牧草和草坪草。介绍了高羊茅的再生体系，从它的转化方法、转化目标、影响因素、生物安全问题等方面综述了高羊茅的外源基因转化研究进展。

关键词高羊茅；再生体系；遗传转化；影响因素；展望

中图分类号S688.4文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)01-0042-03

高羊茅又名苇状羊茅，属于禾本科羊茅属，原产于欧洲西部，我国在20世纪70年代引进，现已是世界温带地区建立人工草地和补播天然草场的重要草种[1]。高羊茅是多年生疏丛型禾草，其具有耐旱耐湿耐热、生长迅速、再生性强等特点，随着我国人工草地建植的不断发展，其建植面积正在不断地扩大。

高羊茅在我国具有广泛的气候和土壤环境适宜性，大部分地区均可种植。它属于多年生冷季常绿型，生长期达8～10个月，可充分利用太阳辐射，耐瘠薄，在黏至砂质土壤上均表现良好。但是，高羊茅在抗旱性、耐寒性方面还需要进一步提高。利用常规育种技术耗时周期长，效率差，存在很多的局限性。利用基因工程技术即将抗逆功能基因有目的、有针对性地导入特定品种的愈伤组织或原生质体，获得改良的转基因植物[2]，如利用转基因技术培育抗旱节水、耐寒的高羊茅新品种就是目前研究的热点。

建立高效的组织培养体系是植物遗传转化的先决条件，高羊茅组织培养方面的研究开始于20世纪80年代，1979年Lowe和Conger从高羊茅成熟种子胚成功地诱导愈伤组织并得到再生植株。此后，人们通过花粉囊培养、幼穗培养、从悬浮培养细胞获得原生质体的培养和成熟种子诱导愈伤的培养等都获得了再生植株。

1高羊茅再生体系

高羊茅等羊茅草种的组织培养开始于20世纪70年代，Dale首先从高羊茅的分生组织顶端培育出小植株[3]，其后，随着研究的不断深入，愈伤组织再生系统、悬浮细胞再生系统、原生质体再生系统等各种途径的高羊茅再生体系相继建立。

1.1愈伤组织再生系统

对于单子叶植物高羊茅来说，选用愈伤组织再生系统是最为理想的，因为单子叶植物悬浮系的建立和原生质体的再生十分困难，而由器官直接分化再生植株难度更大[4]。目前通过对高羊茅不同外植体（如成熟种子、成熟胚、幼胚、幼穗、节外植体、叶片基部的切片、分生组织及花梗组织等）的诱导已经获得了愈伤组织并建立了相关的再生体系[5]。

基因型是影响高羊茅愈伤组织诱导与植株再生的一个重要因素。Eizenga等[6]在对高羊茅研究过程中发现不同品种之间愈伤组织诱导率及其再生频率有显著差异，而且产生愈伤组织最多的基因型未必再生植株最多。Bai等[7]对美国多个高羊茅常见品种进行了比较研究，愈伤诱导率变幅在16.7％～58.8％，分化成苗率1％～22％，并且发现愈伤组织诱导率低的品种，愈伤组织再生频率不一定低。王维飞在研究高羊茅愈伤组织及植株再生过程中认为不同基因型因其内源激素是不同的，故基因型对愈伤组织诱导存在影响。

在常用的植物组织培养基本培养基类型中，高羊茅组织培养采用最多的基本培养基是MS。将不同的植物激素、有机物或其他物质添加到培养基中可以改变愈伤组织的诱导率。与其他禾本科草不同，高羊茅成熟种子诱导愈伤组织需要较高浓度的植物生长物质2，4-D[8]。2，4-D是诱导高羊茅外植体形成愈伤组织的关键因素[4]，最佳2，4-D浓度是5～9mg／L[7，9]，高于12mg／L或低于2mg／L则对愈伤组织的诱导有强烈抑制作用[10]。

1.2胚性悬浮细胞再生系统

禾本科植物悬浮细胞的植株再生比较困难，高羊茅也不例外[11]。胚性悬浮细胞系作为分离原生质体的来源，已经广泛用于体细胞杂交和遗传转化[12]，高羊茅胚性悬浮细胞系的建立，为高羊茅原生质体培养和遗传转化提供了一个极好的体系[13]。相较于愈伤组织再生系统，由高羊茅胚性悬浮培养细胞再生植株的工作在20世纪80年代后期已取得成功[14]，Dalton等[15]采用碳化纤维法转化高羊茅细胞悬浮物，获得了转基因植株。在已报道的高羊茅悬浮细胞再生分化的研究中，大多存在着绿苗再生频率低、白化苗发生率高的问题，胡张华等[16]在试验过程中认为用经2.5mg/L CuSO4·5H2O筛选出的胚性愈伤组织在短期内建立稳定的高质量胚性悬浮细胞系是研究成功的前提；而将悬浮细胞进行高渗处理并结合高浓度琼脂培养是试验成功的关键[16]。

1.3原生质体再生系统

自从1960年英国学者Cocking用酶法首次从番茄根尖分离出大量有活性的原生质体，并通过培养再生细胞壁以来，人们对植株原生质体的分离和培养进行了广泛地探索[17]。原生质体可用于直接基因转移和融合，产生转基因植株和体细胞杂种[18]。据研究报道，从高羊茅细胞悬浮细胞培养系分离的原生质体可以分成4类，即含有大淀粉粒（5～10μm）的具液泡原生质体、含有小淀粉粒（2μm）的具液泡原生质体、只具液泡的原生质体和没有可见液泡的小而细胞质稠密的原生质体[19]。Takamizo[20]等将碘乙酰胺失活的高羊茅原生质体与非形态发生的意大利黑麦草原生质体电融合，并再生获得了若干绿色植株[20]。

2外源基因的遗传转化

2.1转化方法

迄今为止，利用基因工程技术把外源基因导入植物细胞从而实现基因转化方法的技术主要包括PEG法、电激法、硅碳纤维法、基因枪法和农杆菌介导法。Wang等[21]1992年用PEG法以悬浮细胞系为受体，获得了转Hpt和Bar基因的转基因高羊茅；Ha等[22]1992年以胚性细胞为受体通过电激融合法获得了转Hpt和Gus基因的转基因高羊茅；Dalton等[23]1998年首次采用硅碳纤维转导法转化高羊茅细胞悬浮培养物，获得了转基因植株；Spangenberg等[24]1995年通过基因枪法以胚性悬浮系为受体获得了转Gus基因的高羊茅[24]；Bettany等[25]2003年通过农杆菌介导法以胚性悬浮细胞为受体获得了转Hpt和Gus基因的2个独立转基因株系的高羊茅[25]。

2.2转化的主要目标

早期的高羊茅转基因研究的主要是为了建立遗传转化体系，因此所转的外源基因只局限于选择基因Hpt（潮霉素磷酸转移酶基因）和Bar（膦丝菌素乙酰转移酶基因）以及报告基因Gus（葡糖苷酸酶基因）[26]。目前的转化目标主要包括以下几个方面。

2.2.1改良高羊茅的品质。作为牧草型用的高羊茅，提高它的干物质消化率以利于动物吸收，从而改善动物的适口性和其品质与营养价值，采用基因工程育种技术能比传统的育种技术更快的达到目的。Wang等[27]在2001年将向日葵清蛋白SFA8与内质网定位信号KDEL转入了高羊茅，使转基因植株中SFA8蛋白含量占总溶蛋白的0.2%，比未转基因植株的0.01%提高了许多。SFA8含有23%的甲硫氨酸和半胱氨酸，这2种含硫氨酸都属于反刍动物营养中最为限制性的必需氨基酸，将此基因导入牧草型高羊茅，表达产生含硫氨基酸丰富的优质蛋白质，对提高动物生产率具有重要意义。

2.2.2获得抗除草剂性能。随着城市经济的快速发展，草坪草在城市环境美化、绿化扮演着越来越重要的角色，化学除草剂因此得以广泛地应用。目前使用的化学除草剂大多属于高毒高污染的化学药品，它的大量使用将会严重污染土壤、地下水，挥发到空气中还可污染空气，同时还会破坏生态系统。生物除草剂由此诞生，抗除草剂基因是其重要组成部分。抗除草剂基因的表达以其特有的除草剂抗性特征，在植物基因工程技术中得以广泛应用，在很多遗传转化系统中简化了筛选过程。利用抗除草剂基因作为遗传转化筛选标记基因的研究报告有很多。Kuai等[28]1999年获得具有可育性的转基因高羊茅，对除草剂Glufosinate ammonium 有明显的抗性。在以培育抗除草剂植物为目的的研究中，Wang等[29]1992年用抗除草剂基因（bar）转化高羊茅原生质体。

2.2.3提高抗逆性。植物的抗逆性是十分复杂的性状，包括抗寒性、抗旱性、耐盐性等，是多个基因来参与调控的。抗逆基因的分离、克隆和转化一直都是国内外科学家研究的热点。目前已经分离出大量相关的基因，如抗寒有关的Mn-SOD基因等、抗旱有关的拟南芥CBF基因等、耐盐有关的脯氨酸合成酶基因等。提高高羊茅的抗旱性，既可以降低它作为草坪草的管理费用，又能使它在干旱地区得以广泛种植。任伟[30]通过根瘤农杆菌介导DREBIA基因转化高羊茅获得了抗旱性牧草株系。梁蕊芳[31]利用基因枪法将NHX1、CBF耐逆相关基因导入高羊茅获得了相关的抗性植株。

2.2.4提高抗病害性。病虫害普遍存在于高羊茅的生产中，病虫害多、分布广，严重影响生产。化学药品的过度使用使得各病虫害的耐药性加强，而传统的育种技术周期过长，无法满足目前的生产需求。目前的抗虫基因主要包括植物外援凝集基因、蛋白酶抑制基因和Bt基因。抗病毒基因的技术路线有：导入病毒外壳蛋白(Coat protein，CP)基因；利用病毒的卫星RNA(Satellite RNA，Sat- RNA)；利用病毒的非结构蛋白基因，特别是复制酶—replicase 基因；利用人工构建的缺损干扰颗粒(Defective interfering particle)；利用植物本身编码的抗病毒基因和利用动物中的干扰素(Interferon)基因；利用反义RNA 技术；利用中和抗体法技术；设计核酶剪切病毒RNA 等。在这些技术路线中，导入CP基因是目前最为成功的一种[32]。

2.3 遗传转化的影响因素

2.3.1筛选方法的选用。目前，在植物遗传转化中常用的选择标记大多用抗生素作为筛选标记基因，主要有以下类型：新霉素磷酸转移酶基因(NptII基因，具有抗卡那霉素或G418 特性)、潮霉素磷酸转移酶基因(Hpt基因，具有抗潮霉素特性)、除草剂转移酶基因(Bar基因，提供对除草剂Basta的抗性)等[33]。在高羊茅的遗传转化中，研究人员大多采用潮霉素磷酸转移酶基因筛选，简单不连续筛选时，植株再生最多，但导致大量逃逸植株的产生；而采用低浓度潮霉素连续筛选，虽然一些未转化愈伤组织能够存活和生长，但不能再生植株，因而产生的转基因植株数最多且没有逃逸[34]。

2.3.2抗生素的使用。农杆菌介导转化法在高羊茅的遗传转化中已获得了成功，在筛选转化体的培养基中需要加入抗生素以杀灭农杆菌。高羊茅的研究中常使用头孢霉素与羧苄青霉。吴关庭等[35]在研究抗生素对高羊茅胚性愈伤组织生长与分化的影响时发现头孢霉素明显抑制愈伤组织生长，而浓度低于500mg／L的羧苄青霉素能促进愈伤组织生长；2种抗生素对愈伤组织分化均有抑制作用，但羧苄青霉素的抑制作用要比头孢霉素小。

2.3.3培养时间。采用胚性细胞悬浮物为再生系统时，悬浮物培养时间对高羊茅再生植株影响明显。Kuai和Morris (1995)[41]研究表明，用于分离原生质体的细胞培养物的继代保存时间和分离前的继代培养时间对Gus基因的瞬间和稳定表达有显著影响。随着悬浮培养物继代保存时间的延长，一方面，正如前面所指出的那样，植株再生能力下降，白苗增多，另一方面，Gus基因瞬间表达水平和稳定表达频率逐渐降低。使用从继代培养3～4d的悬浮培养物分离的原生质体，其Gus基因瞬间表达水平最高，而使用从继代培养1d和7d的悬浮培养物分离的原生质体，其Gus基因瞬间表达水平还不到其1/2。原生质体分离前的继代培养时间对Gus基因瞬间表达的影响与细胞培养物的生长率和蛋白合成速率密切相关。

2.3.4植物激素。激素是细胞、组织培养中除了遗传因素之外非常重要的因素，并且非常难掌握。对禾本科草类而言，起主要作用的是生长素类、分裂素类和脱落酸类，应用于高羊茅的也主要是这3类激素。高羊茅在组织诱导中需要高浓度的2，4－D，最适浓度为9.0mg/L[36]；6－BA的使用浓度为1.0～3.0mg/L[37]；在高羊茅悬浮细胞系的建立及绿色植株的高频再生的研究中发现，不同浓度的ABA对高羊茅成熟胚愈伤组织诱导率有显著影响，以ABA为2.0mg/L时的诱导率最高，且可有效抑制胚芽和根的生长，显著提高其成熟胚愈伤组织的诱导率[16]。

2.3.5污染及白化苗问题。高羊茅在组织培养过程中污染现象远远高于其他草种，且愈伤组织诱导率一直很低。后有研究者发现这与高羊茅体内共生的顶孢霉素真菌有关。Samposon于1933年首次报道了禾本科牧草叶鞘组织内有真菌存在。李剑等[40]在检测高羊茅种子内生真菌的研究中，所测的7个样品有4个品种都含有内生真菌，且猎狗5号品种带菌率达80%。现在研究人员常采用不同的种子处理方法以减少内生真菌对组织诱导的影响。高羊茅再生植株白化现象在组织培养中普遍存在，问题很突出。在Rajoelina等[38]1990年的研究中，15%的高羊茅愈伤组织完全再生白化植株，另有18%的愈伤组织同时再生白苗和绿苗。Takamizo等[39]1990年再生获得188个原生质体来源的高羊茅植株，其中白化苗多达145个，占77.1%。

2.4遗传转化生物安全问题

作为牧草型用的高羊茅，在日常使用过程中，由于缺乏适度修剪常导致开花结实，花粉通过自然或人为因素的传播引发潜在的生物安全问题，特别是抗除草剂基因的转入存在向野生杂草转移的可能。但不少研究者认为草类植物异交率很低，种间杂交情况很少[42]。作为草坪型用的高羊茅在城市绿化中通常是通过适当的修剪进行养护管理，不会存在开花结实的问题。无论怎样，转基因植物的生物安全仍然是全世界普遍关注的问题之一，对转基因植物的安全性评价主要集中在2个方面，一个是环境安全性，另一个是食品安全性。目前很多国家都已制定了各自对转基因生物的相关管理法规，对其安全性进行评价和监控。

3展望

高羊茅的遗传转化是21世纪草坪草和牧草转基因研究的一个热点。自20世纪80年代以来，我国农业生物基因工程技术迅速发展，到目前为止，高羊茅遗传转化研究已经建立了多套转基因技术体系，取得了较大进展。高羊茅作为我国主要应用的草坪草和牧草草种之一，仍存在巨大潜力空间，但所需的草种基本依靠国外进口，培育适合我国本土环境生长需求的新品种势在必行。虽在研究过程中面临种种困难，但随着农业生物工程基因技术的发展，问题将逐一解决。迄今为止，高羊茅已有子代转基因遗传稳定性的研究，而大部分其他种类还仅局限于转化研究阶段，这也将极大促进高羊茅遗传转化的更快速发展。

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