植物苯丙氨酸解氨酶研究进展

高　雪

摘要苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL，E.C4.3.1.5)是催化苯丙烷代谢途径第一步反应的酶，也是这个途径的关键酶和限速酶，对植物具有非常重要的生理意义。综述了苯丙氨酸解氨酶的存在与分布、基本特性、生理代谢意义、抗病以及基因表达与调控等，为PAL在植物抗病的应用上提供基础数据。

关键词苯丙氨酸解氨酶；生理作用；抗逆境；基因表达与调控

中图分类号S661.1文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)01-0030-04

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL，E.C4.3.1.5)催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，也是苯丙氨酸代谢途径的关键酶和限速酶。莽草酸途径产生的莽草酸通过分枝酸、预苯酸经转氨作用生成苯丙氨酸，从而进入苯丙烷类代谢途径，苯丙烷类代谢可生成反式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物，这些中间产物可进一步转化为香豆素、绿原酸，也可以形成CoA酯，再进一步转化为木质素、黄酮、异黄酮、生物碱、苯甲酸酯糖苷等次生代谢产物[1，2]。一切含苯丙烷骨架的物质都由该代谢途径直接或间接生成。在生物次生物质代谢中具有防紫外线伤害、抵抗病原体的侵害、保持花粉生活力及形成植物花青素等多种重要作用。该酶在不同组织中、不同的内外因素调节下，含量水平及其基因表达的时空方式均有所不同。

1PAL的存在和分布

1961年Koukal和Conn首次在绿色植物大麦幼苗中发现了PAL，并进行了分离纯化[3]。随着研究的深入，该酶已被固定化，用于工业化生产苯丙氨酸。至今，PAL已在所有绿色植物中发现，在真菌、细菌、藻类中也有存在。不同植物中PAL活性不同，在同一株植物的不同组织部位，PAL活性也不同。一般越嫩的部位PAL活性越高，如杨树的幼叶、顶芽、幼茎中PAL活性最高，而老茎和成熟叶中PAL则较低[4]。

在细胞水平上，植物PAL主要分布在表皮下的细胞和维管组织细胞中；在亚细胞水平上，PAL定位于细胞质和一些细胞器上，如叶绿体、白色体、线粒体、过氧化酶体、乙醛酸体等。Nakushima等进行了PAL的亚细胞定位，发现细胞间质部分PAL活性最高，电子显微镜观察显示，PAL分散在细胞的基质中，定位在高尔基体囊泡和次生壁加厚层中[5]。

2PAL的基本特性

PAL是一种胞内诱导酶，酶蛋白是一种含有4个相同亚单位的寡聚体，氨基酸组成随不同来源而异，如水稻PAL氨基酸组成中酸性氨基酸成分低于小麦、玉米和马铃薯，而中性及碱性氨基酸成分则高于后三者[6]。在酶活性部位具有脱氢丙氨酰基的亲电中心。酶蛋白分子量一般在220～330 KDa，但不同来源稍有差异，如马铃薯PAL分子量为330KDa，玉米为306KDa，小麦和水稻PAL分子量分别为280KDa和230KDa[1]。不同来源的PAL最适pH值在8.0～9.5。如甘薯PAL最适pH值为8.5～9.5，水稻为9.2，小麦为8.8，与其氨基酸组成相一致[7]。

该酶的动力学曲线不符合米氏方程，不规则，具有别构酶的特征。大多数PAL的米氏常数(Km)在0.3×10^-4～1.5×10^-2mmoL/L，水稻PAL的Km为5.94×10^-4mmoL/L；而小麦PAL的Km有2个，分别为0.625×10^-4 mmoL/L和3.1×10^-4mmoL/L[1，6]。

3PAL对植物生理代谢的意义

植物的代谢分为初级代谢和次级代谢。植物的次级代谢有多条途径，苯丙烷类代谢途径是其中很重要的一条。苯丙烷类途径生成的黄酮、异黄酮、生物碱等次生代谢产物在植物的生长发育过程中起着重要的作用，所以PAL对植物的生理意义非常重大(见图1)。

3.1在木质化中的作用

在植物的木质化组织中含有较高的PAL活性。Nakashima等用分离的百日草叶肉细胞研究了苯丙烷类代谢酶类与木质素、管状分子形成和细胞分化的关系，发现在百日草细胞分化过程中，木质素的合成及管状分子形成与PAL活性的增加成正相关，细胞溶质中的PAL活性在木质化之前迅速上升，微粒体和细胞壁的PAL活性在木质化期间快速增加[5]。

3.2在植物色素形成过程中的作用

花色素是植物花朵、果实和叶片颜色的重要组成部分，花色素等的合成可由苯丙烷类产物反香豆酰CoA经过类黄酮途径生成，该过程与PAL密切相关。如苋红素是中央种子目植物所特有的色素，当用白光、蓝光或红光照射尾穗苋黄化苗后，发现PAL活性均有不同程度地上升，并有苋红素的积累[8]。有人通过调节PAL合成基因的表达，有效地改变了矮牵牛、烟草和菊花的花色[9]。因此，利用分子生物学技术有可能改变苹果等果树果实的色泽。

3.3在植物根瘤形成中的作用

苯丙烷类代谢产物经类黄酮途径可产生黄酮类化合物，这些化合物对根瘤菌有趋化作用，有些类黄酮化合物还可作为根瘤菌结瘤基因的诱导物质[10]。这些黄酮类物质的含量与PAL活性存在着密切的关系，在根瘤菌的形成过程中常伴随着PAL活性逐渐增强。

4PAL在植物抗逆境中的作用

研究发现，许多植物在遭受寒冷、机械损伤、微生物侵染等逆境时，植物的防卫系统特别是苯丙烷类代谢被激活，PAL活性迅速上升。如柑橘果实受机械损伤后，果皮中PAL的活性明显高于对照，且pal2、pal6基因的表达比对照明显增强[11]。因此，PAL活性可作为植物抗逆境能力的一个生理指标。

4.1PAL在植物抗病中的作用

PAL活性与植物抗病性密切相关，其活性可作为衡量植物抗病性的生化指标之一。植物感染病原菌后PAL活性明显升高，并表现出规律性的变化，即在侵染的最初几小时，酶活性上升滞缓，随后急剧上升，酶活高峰一般出现在侵染后的12～48ｈ，之后迅速下降。受病原物侵染后，不同抗性的品种(系)间PAL活性有明显差异，抗病品系诱导产生的PAL活性远高于感病品系，且PAL活性越大，品种(系)抗病性越强。如张淑珍等在对疫霉根腐病菌毒素胁迫下不同大豆抗感品种PAL活性的研究中发现，抗病大豆品种的根、茎和叶中PAL活性在病程的大部分阶段都高于对照[12]。PAL参与植物抗病的机制和作用主要有如下几点。

4.1.1参与植保素的合成。植保素是参与植物防御反应的重要生理活性物质之一，主要包括酚类植保素(绿原酸、香豆素和儿茶酚等)、异黄酮类植保素(豌豆素、菜豆素、大豆素、苜蓿黄素等)和萜烯类植保素，它们能直接防止病原物的生长发育和侵染。其中，前两类都是苯丙烷类代谢的直接或间接产物，其生成量与PAL活性成正相关[1]。当用PAL抑制剂Ｌ-2-氨氧基-3-苯丙酸和α-氨氧基-乙酸处理植物幼苗，植物体内植保素合成和累积受到抑制[13]。

4.1.2参与木质素的合成。木质素可加强细胞壁，增加组织木质化程度，形成病原菌入侵的机械屏障，木质素的合成也来自苯丙烷类代谢途径中的苯丙氨酸。PAL是这条途径的第一个也是最重要的酶。研究表明，在植物-病原物互作中，PAL参与木质素合成和累积。如棉花受枯萎病菌侵染后，随着PAL活性提高， 出现木质素的积累。PAL受抑制，木质素合成亦受到抑制[14]；不同抗病性的杉木接种炭疽菌后，PAL比活力均上升，且抗病性强的杉木PAL比活力比抗病性弱的杉木高[15]。

4.1.3参与酚类物质的合成。酚类化合物也是苯丙烷类代谢产物。PAL活性增高与酚类物质的合成亦有一致性。如感染灰霉病的黄瓜组织中，伴随PAL活性升高，总酚积累[16]；在用多糖组分处理后，提高红豆杉中酚类物质和可溶性蛋白含量的同时，过氧化物酶和PAL的活性也被激活[17]。

4.2PAL与植物抗虫性的关系

关于PAL参与植物抗虫方面的研究报道较少，但关于苯丙烷类代谢途径与植物抗虫性的报道已有很多，主要集中在这一代谢途径的产物(木质素、植保素)与植物抗虫性的关系方面。木质素的积累，可使细胞壁加厚，成为食草类动物取食的机械障碍，而植保素对草食性昆虫具有毒害作用和趋避作用，这些化合物的生成与PAL含量存在着间接的关系。许多试验证明，PAL活性高低与植物的抗虫性有很大关系，如吴龙火等在研究5种山羊草对禾谷缢管蚜取食的诱导性抗性机理时发现，PAL酶活提高率与蚜虫取食诱导有关[18]。而且食草类动物的取食也可诱导PAL活性升高[19]。

5植物PAL基因的表达与调控

5.1植物PAL基因的克隆

完整的Rhodotorula toroloides PAL基因序列已有报道(Genebank/M18261)。1987年，Anson等从R.toruloides中克隆出了PAL基因，测得了其核苷酸全长序列，发现R.toruloides PAL基因有6个内含子，结构基因上游有一段富含C+T的序列，这与脉孢菌(Neurospora)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的某些基因具有相似性，而在S.cerevisiae中这段富含C+T序列在一些高表达基因的转录中具有重要的作用[20]。这提示PAL基因中这段富含C+T序列对表达的意义，有利于PAL基因工程菌的构建。同时，Anson归纳出了编码R.toruloides PAL基因的密码子的使用频率[20]。这对从cDNA(DNA)中扩增PAL基因时设计PCR引物具有重要的参考价值。迄今为止，对植物PAL基因的研究最多，已有多种植物的PAL基因序列已经测定并公布在GeneBank中。

5.2植物PAL基因的表达调控

对苯丙烷类代谢途径的调控包括酶的内部调节和外界因子调控两个方面。它们的表达受发育和环境信号的调节，具有严格的组织时间特异性[1]。

5.2.1植物体内对PAL酶的内部调节。PAL酶活性随植物发育过程的推进而不断变化。一般PAL酶活性最初较低或没有，后上升到一个高峰后下降，达到高峰的时间不同植物有所不同，如水稻9d、小麦7d、胡萝卜60h。植物体内有一种内源性抑制物质(PAL-inhibitor， PAL-I)参与PAL活性的调节。从去胚乳的水稻黄化苗中提取并部分纯化了PAL-I，它是非透析的蛋白质，大部分活性可被蛋白酶破坏，具有热稳定性。动力学实验表明，PAL-I对PAL的抑制是竞争性的。水稻PAL-I不仅能抑制水稻PAL，还能抑制从小麦、玉米、马铃薯中提取的PAL，但不能抑制水稻中提取的其他酶类，如多酚氧化酶[21]。研究还发现，单子叶植物幼苗胚乳中普遍存在PAL内源抑制物质的调节因子(PAL-inhibitor-regulator， PAL-IR)，去胚乳后，内源抑制物质增加，幼苗中PAL活性下降。目前认为胚乳对幼苗PAL活性的调节作用在禾本科植物中具有普遍意义，而双子叶植物子叶对PAL的调节作用不具有普遍性，要比单子叶植物的胚乳复杂的多[1，21]。

PAL酶除自然降解、钝化因子和调节因子外，还受其末端产物的调节。酶抑制剂有许多种类，如肉桂酸、ρ-香豆酸、α-氨氧基乙酸和一些氨基酸如组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等。不同来源的PAL对同一种类抑制剂的敏感性不同。如来源于大麦和红酵母的PAL对硫氢基类抑制剂敏感，而来源于马铃薯、玉米、黑粉菌和链霉菌的则不敏感，这种对酶活性的抑制同酶活性部位脱氢丙氨酰基的丧失和减少相伴随，其机理可能是对脱氢丙氨酰残基的修饰[7]。

5.2.2外界因子对PAL酶的调控。PAL是一种诱导酶，可受多种因素的诱导。低温、机械损伤、光(白光、蓝光、红光、紫外光)、病原菌感染、毒素处理、昆虫取食、矿质营养、悬浮细胞的稀释和外源植物激素等因素都可以在转录水平上诱导PAL基因的表达［22，23］。如用真菌诱导子接种欧芹叶细胞悬浮培养液，接种后6～8h，PAL mRNA在大范围内高度表达，且明显高于对照；约12h后，PAL mRNA收缩到坏死斑周围，并在此区域内，PAL酶蛋白有所增加；接种25h，PAL mRNA表达基本恢复到原来水平，而PAL酶蛋白在坏死斑周围被强烈地诱导合成[24]。

生长素(IAA)、激动素(BAP)和乙烯都可诱导植物PAL基因的表达，剌激效应乙烯＞IAA＞BAP。还有研究表明，赤霉素(GA3)也能诱导PAL活性的升高[1]。植物在生长发育过程中以及受病原菌及其诱导物和伤害等刺激时，PAL常伴随内源乙烯合成的增加而积累。如在西瓜果实发育中，PAL基因随着乙烯生物合成基因的表达而表达[25]；马铃薯在用外源乙烯处理后，PAL mRNA的水平增加[26]。说明乙烯可能是植物PAL诱导表达的内源信号分子。各种诱导因子间还存在着互作关系，如在切伤诱导甘薯块根切片PAL活性增高时，IAA、BAP和乙烯处理能使PAL的活性再增加，BAP的效应还可被照光而增强[7]；在尾穗苋黄化苗PAL与苋红素积累的相关性研究中，也观察到光对BAP的刺激作用有增效现象[8]。

5.3调控机理

PAL是由一个多基因家族控制，不同组织有多种PAL同工酶，分别定位于不同的组织细胞，控制不同的代谢途径[1，7]。研究表明，植物PAL基因结构的普遍特点是由小的多基因家族组成，在1组染色体中，含有1至多个PAL基因，并随不同植物而异，基因内一般含有1个内含子。如菜豆基因组包含3 个PAL基因，即PAL1、PAL2、PAL3。它们都可在根部大量表达，而花瓣中PAL2大量表达，PAL1表达量很少，PAL3不表达；这3个PAL基因都能被机械损伤诱导，而PAL1和PAL2能被真菌细胞壁诱导因子所诱导。此外，在机械损伤的细胞和木质部细胞都能检测到PAL2的活性[27]。这与其生理功能一致，因为在木质部的正常发育过程中，木质部的形成也是从PAL所催化的反应开始的。植物细胞受伤时用于填补伤口的物质的合成也需要PAL。

PAL多基因家族在表达上的差异是由于它们的启动子所包含的顺式作用元件不同而引起的。由顺式作用元件和相应的转录因子共同作用，控制PAL基因在不同时间和组织中的表达。植物PAL基因启动子在转基因植物中的表达调控也说明了这一点。有人将菜豆(PAL2、PAL3)、拟南芥(PAL1)等植物PAL基因的启动子与β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-Glucuronidase，GUS)报告基因融合转移到马铃薯、烟草、拟南芥中，通过检测报告基因活性，来研究PAL启动子在转基因植物中的表达调控模式及表达的细胞和组织特异性。他们发现用亲和性的Pseudomonas solanacearum野生型菌株K60，或不亲和性的无毒性突变株B1，接种含有拟南芥PAL1-GUS基因融合物的转基因烟草植株，迅速诱导了GUS基因的大量表达[28]；将菜豆PAL2-GUS和PAL3-GUS转入拟南芥、马铃薯和烟草中，其表达受环境刺激因子的诱导调控，也受转基因植物发育阶段调控，表现出不同的时空表达模式[28]。GUS表达的组织化学分析表明，菜豆PAL基因启动子，在转基因马铃薯和烟草的特定细胞——机械损伤的细胞中表达，也可在发育中的木质部(射线细胞)和花器中表达[29]。这些结果表明，PAL基因启动子在转基因植物中的表达，也受病原菌、转基因植物的发育阶段及其他环境因子的诱导调控。

6结语

PAL是植物次生代谢中一种非常重要的酶类，在植物的生长发育、抗病反应等过程中起着非常重要的作用。随着分子生物学的不断发展，大量PAL基因的克隆、测序、结构特点分析及时空表达模式的研究，将为在转基因植物中大量、持久表达PAL酶，提高次生代谢产物的含量，增强植物对病害的广谱持久抗性及其他农艺性状具有非常重要的作用。同时深入研究PAL基因启动子及相关转录因子，不仅可以进一步阐明PAL基因的调控机理，还能为增强作物抗病性、作物的遗传改良等研究开辟新的思路，具有广阔的应用前景。

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