NaN3处理条件下西瓜直接再生试验体系研究

杨国志 张明方 顾掌根 缑艳霞

（1.浙江嘉兴市农科院，314016；2.浙江大学园艺系；3.呼和浩特职业技术学院）

NaN3处理条件下西瓜直接再生试验体系研究

杨国志1张明方2顾掌根1缑艳霞3

（1.浙江嘉兴市农科院，314016；2.浙江大学园艺系；3.呼和浩特职业技术学院）

以西瓜纯种自交系伊选为材料，研究了化学诱变剂NaN3对西瓜直接再生试验体系的影响。研究发现，随着叠氮化钠浓度的升高，显著的延迟了种子萌发、胚根发生、子叶开展、不定芽分化、伸长以及生根的时间，降低了芽分化频率和每个外植体分化的不定芽数。1.5 mmol/L的NaN3振荡处理1.5 h为最佳的诱变处理，使外植体再生频率降低到40.0%，不定芽数/外植体降低到4.3，符合抗冷突变体半致死剂量的要求。

化学诱变 NaN3不定芽分化 半致死剂量

利用化学诱变剂，能诱导无性系的高频率变异，通过一定的选择压力，可以筛选到一些有益的突变性状和性状优良的突变体。本试验以西瓜自交系纯种伊选为材料，采用化学诱变和植物组织培养相结合的方法，诱导和筛选西瓜抗冷突变体，建立在化学诱变剂处理条件下的西瓜直接再生试验体系，确定西瓜子叶生长、不定芽分化的最佳诱变浓度以及最适培养条件，确定抗冷突变体的半致死剂量；并对种子的发芽率、分化的不定芽数等进行统计和形态观察。为以后化学诱变剂存在条件下的西瓜体细胞无性系变异、基因转化和突变体后代遗传鉴定分析等方面的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所选用的材料为优质自交系纯种伊选（‘YiXuan’YX-04），以子叶刚刚展开的无菌苗的下胚轴与子叶之间再生能力强的部位作外植体，用来分化不定芽。

培养基及培养条件为发芽培养基：MS＋20 g/L蔗糖＋7 g/L琼脂；芽分化培养基：MS+5 mg/L BA+ 0.1 mg/L IAA，芽伸长培养基：MS＋0.1 mg/L KT；生根培养基：MS+0.1 mg/L NAA。上述培养基均用1 mol/L的NaOH或HCL将pH值调至5.8，121℃恒温灭菌20 min[1]。

1.2 试验处理

NaN3浓度用0.1 mol/L，pH值3.0的磷酸缓冲液配制NaN3溶液，过滤灭菌，设4个诱变浓度处理分别为 0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L。以磷酸缓冲液（CK2：0.1 mol/L磷酸缓冲液处理种子1.5 h）和不加磷酸缓冲液与叠氮化钠（CK1：没有做任何处理）处理为对照。

1.3 试验方法

①将成熟、饱满一致的伊选种子在30℃的蒸馏水中浸泡5～6 h，小心去壳后浸入10%次氯酸钠溶液中，置摇床上振荡消毒10 min。用无菌水冲洗消毒后的种子3～4次，然后将其接种到发芽培养基上。先在黑暗条件下28℃培养箱内培养，待90%以上种子胚根露出0.5～3 mm以后，将其转移到25℃，35～40 μmol·（m2·s）-1光照培养条件下继续培养，直至子叶展开，用于分化不定芽。

②将成熟、饱满一致的伊选种子在30℃的蒸馏水中浸泡5～6 h，小心去壳后用0.1 mol/L，pH值3的磷酸缓冲液振荡处理（180 r/min，25℃）1.5 h。再用自来水冲洗3～4 h，浸入10%次氯酸钠溶液中，置摇床上振荡消毒10 min。用无菌水多次冲洗消毒，然后将其接种到发芽培养基上。以下步骤同①。

③选取成熟、饱满一致的伊选种子浸泡5～6 h，小心去壳后用0.1 mol/L，pH值3的磷酸缓冲液配制的规定浓度的NaN3振荡处理（180 r／min，25℃ ）1.5 h。NaN3浓 度 分别为0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L。种子经诱变剂处理后，用自来水冲洗3～4 h，再浸入10%次氯酸钠溶液中，置摇床上振荡消毒10 min。然后将用无菌水多次冲洗消毒后的种子接种到发芽培养基上。以下步骤同①。

④芽分化、伸长和生根培养。每个处理接种30粒种子，设3次重复。待种子发芽后，统计种子发芽率、胚根伸长量和子叶开展与时间的关系。以刚刚开展的子叶为外植体，将展开子叶的近轴端（带1 mm左右的下胚轴）外植体接种到诱导不定芽分化培养基上 （MS+30 g蔗糖＋7 g琼脂＋BA 5 mg/L+IAA 0.1 mg/L，本研究后面所用培养基均加30 g蔗糖和7 g琼脂，pH值均调至5.8）。每个处理接种5个外植体，设3次重复。直至不定芽长至0.5～1.0 cm时。统计芽分化时间、植株再生频率和平均芽数。

将分化后的不定芽（芽长0.5～1.0 cm）转到芽伸长培养基上进行伸长培养（CK1和CK2直接接种到生根培养基上进行生根培养，统计生根所需天数），待不定芽在伸长培养基上长至1.5～2.0 cm后，对不定芽进行形态观察并统计伸长时间。

将不定芽自基部切下，转到MS＋0.1 mg/L NAA的生根培养基上生根培养20 d左右，待根生长到2～3 cm时，对不定芽进行形态观察并统计生根时间。生根幼苗在5℃低温处理2 d，0℃低温处理1 d后，转到培养室继续正常培养1周，然后开瓶炼苗2 d，洗掉根部的培养基后移栽到装有蛭石的营养钵中。用塑料薄膜遮盖以保湿，并保持适当通风透气，期间浇灌1/2的MS营养液。4 d后揭去薄膜，在有散射光的室内培养5 d，然后移栽到温室培养。

⑤半致死剂量及相关关系的确定。半致死剂量是诱变育种适宜诱变剂量的参考，以不同浓度叠氮化钠处理产生的不定芽的再生频率计算其半致死剂量，即以不同诱变剂量x为自变量，不同剂量下的不定芽的再生频率y为因变量，利用直线回归方程y=a+bx和下列公式来计算诱变育种适宜的半致死剂量。式中，b为回归系数；a为常数；x为所求半致死剂量。

相关系数反应了不同的不定芽的再生频率与诱变剂量的相关性质及其紧密程度。相关系数为：

2 结果与分析

2.1 NaN3处理对西瓜发芽率和成苗率的影响

从表1可以看出，磷酸缓冲液对照处理和未做任何处理的对照之间对西瓜的发芽率和成苗率的影响没有区别。但随着NaN3浓度的增加，伊选的发芽率和成苗率呈逐渐下降的趋势，当NaN3浓度为1.0 mmol/L时，发芽率和成苗率分别为66.7%和60.0%；当NaN3浓度为1.5 mmol/L时，发芽率和成苗率还保持在55.0%左右，但当NaN3浓度变为2.0 mmol/L时，伊选的发芽率和成苗率则分别骤降到30.0%和33.3%。相对1.5 mmol/L时，发芽率和成苗率同比分别下降了47.1%和70%。伴随着NaN3浓度的升高，幼苗畸形的比例也相应增加，主要表现为幼苗矮化，胚根变细，子叶叶面积变小，子叶上部发白或发黄，子叶变硬等。

表1 NaN3处理对西瓜子叶伸展和西瓜不定芽直接再生的影响

2.2 NaN3处理对西瓜胚根伸长的影响

低浓度的NaN3处理对胚根的伸长影响较小，0.5 mmol/L浓度处理的种子在第3 d胚根就伸长到2.0 mm左右。1.0 mmol/L浓度处理的种子胚根伸长趋势和0.5 mmol/L浓度处理的种子相似。但高浓度的NaN3处理则显著的抑制了胚根的伸长，当NaN3浓度达到1.5 mmol/L时，明显的抑制了胚根的伸长生长，在第3 d胚根才伸长到0.5 mm，第6 d胚根才仅仅2.0 mm。当NaN3浓度为2.0 mmol/L时，胚根在前4 d基本没有伸长，到第6 d时也只有1.5 mm长。而2个对照之间胚根的伸长几乎没有差别，都在第2 d的时候达到5 mm左右。

2.3 NaN3处理对西瓜子叶伸展的影响

将在黑暗条件下28℃培养箱内培养的种子转到光照培养室继续培养，观察子叶伸展的情况，统计从黑暗条件下培养到光下培养，子叶刚刚开展所需要的时间。

从表1可以看出，低浓度的NaN3处理对子叶伸展所需时间基本无影响，0.5 mmol/L浓度处理和1.0 mmol/L浓度处理在第4 d的时候子叶开展；而高浓度的NaN3处理则明显延长了子叶伸展的时间，随着NaN3浓度的增大，子叶伸展时间最多的延迟了5 d。磷酸缓冲液对照处理和未做任何处理的对照对子叶的伸展影响一致，子叶都在第3 d的时候展开。

2.4 NaN3处理对西瓜不定芽分化的影响

①NaN3处理对不定芽生长的影响 将展开子叶的近轴端（带1 mm左右的下胚轴）外植体接种到诱导不定芽培养基上。直至不定芽长至0.5～1.0 cm。统计芽分化时间、植株再生频率和平均不定芽数/外植体。磷酸缓冲液对照处理和未做任何处理的对照之间不定芽的分化情况基本一致，都在10 d左右出现，在15 d左右不定芽伸长到6～7 mm。低浓度的NaN3处理对不定芽分化影响较小，中等浓度和高浓度的NaN3处理对不定芽分化影响较大，不仅延迟了芽分化的时间，而且分化出的不定芽叶片比没有经过处理的叶片细，出现皱缩，生长缓慢，外植体边缘有轻度黄化现象。如2.0 mmol/L浓度处理在16 d时才有不定芽产生，在25 d时不定芽的伸长也仅仅有5 mm。

②NaN3处理对不定芽直接再生的影响 试验结果表明，高浓度的NaN3溶液处理对西瓜直接再生不定芽的再生频率、不定芽数都有显著影响。从表1可以看出，1.0 mmol/L和1.5 mmol/L处理无论对再生频率还是不定芽数的影响都比较适中，既能保证获得一定数量的不定芽，又能达到一定的选择效果，基本上符合半致死处理条件。求得的直线回归方程为y=-0.253x+0.8，诱变的半致死剂量为1.18 mmol/L，相关系数为0.93。1.5 mmol/L处理和2.0 mmol/L处理，分别使再生频率降低到40.0%和33.3%，每个外植体分化的平均不定芽数分别降低到4.3个和3.4个。与对照CK1和CK2的再生频率100%和平均芽数7.8个相比，差异极显著。1.0 mmol/L和1.5 mmol/L处理再生频率间差异不显著。考虑到突变频率的提高和突变体植株发生数量的关系，直接再生途径NaN3处理诱导体细胞无性系变异试验中，采用1.5 mmol/L浓度处理诱导子叶外植体不定芽的发生较好，既能得到较高的突变频率，又能保证得到一定数量的突变体植株。

③NaN3对不定芽伸长的影响 CK1和CK2在芽分化培养基上培养15 d后，将再生芽自芽基部切下插入生根培养基直接生根培养。而NaN3处理过的种子分化的不定芽在分化培养基上培养后，则接种到伸长培养基上继续伸长培养。0.5 mmol/L处理的不定芽生长较快，不定芽10 d左右就伸长到2.0～2.5 cm，1.0 mmol/L处理的不定芽生长趋势和0.5 mmol/L处理的不定芽生长趋势一致，在15 d左右达到最大的伸长量2.5 cm。1.5 mmol/L处理和2.0 mmol/L处理的不定芽生长比较缓慢，分别在20 d和25 d的时候达到各自的最大伸长量2.5 cm和2.0 cm。

2.5 NaN3处理对西瓜生根的影响

不定芽在伸长培养基上伸长培养后，转到生根培养基上培养，统计生根培养所需时间。低浓度的NaN3处理对根的生长有轻微的抑制作用，高浓度的NaN3处理不仅延长了生根时间，而且也抑制了根的伸长，如1.5 mmol/L处理和2.0 mmol/L处理在第 25 d时根长分别是 2.5 cm和 2.0 cm。而 0.5 mmol/L处理和1.0 mmol/L处理根的伸长量分别在19 d和22 d的时候已达到3.5 cm。

3 小结与讨论

磷酸缓冲液对伊选的胚根伸长、子叶开展、不定芽分化和生根所需时间以及幼苗的形态建成基本没有影响，经过磷酸缓冲液处理后产生的幼苗、分化的不定芽以及生根后的幼苗在生理形态上和未做任何处理的对照基本一致，两者之间不存在显著差异。郑蔚虹等[2]用7．5 mmol/L，pH值5．8的磷酸缓冲液浸番茄种子5 h，结果促进了番茄种子萌发和幼苗生长，而且幼苗在受低温胁迫[（5±1）℃，48 h]时，磷酸缓冲液能有效地降低相对电导率、减缓MDA的积累，减轻膜质过氧化作用，稳定膜系统的结构与功能，促进脯氨酸积累，从而提高番茄幼苗的抗冷性。然而在本试验中，磷酸缓冲液浸种对西瓜种子萌发和幼苗生长基本没有影响，和未作任何处理的对照之间差异不显著。

0.5 mmol/L的NaN3溶液处理对胚根的伸长、子叶的开展、不定芽的分化、不定芽/外植体数、不定芽的伸长和生根影响轻微，与对照CK1和CK2没有显著性差异。1.0 mmol/L和1.5 mmol/L的NaN3溶液处理对胚根伸长、子叶开展、不定芽分化、不定芽/外植体数、不定芽伸长和生根影响显著，显著的延迟了胚根发生、子叶开展、不定芽分化、伸长以及生根的时间，降低了芽分化的频率和不定芽/外植体数，如1.0 mmol/L处理和1.5 mmol/L处理，分别使再生频率降低到46.7%和40.0%，不定芽数/外植体分别降低到4.7和4.3。2.0 mmol/L NaN3处理对芽分化、芽伸长和生根都有很强的抑制作用，芽分化时间变长，外植体分化频率降低，每个外植体芽分化个数减少，褐化和玻璃化的外植体个数增加，分化的不定芽较矮小和紧凑，分化的不定芽在伸长和生根培养基上生长不良，表现为叶皱缩，变细，分枝增多，生长缓慢或停滞等。

张兰等[3]用叠氮化钠对苹果叶片进行诱变处理，研究发现叠氮化钠对叶片再生有明显影响，其存活率、再生率和再生芽数均比对照有所下降。张超美[4]的研究也表明，叠氮化钠对小麦幼苗生长有抑制作用，在萌发初期主要表现为对种子启始萌发的延滞效应，且延滞时间随处理浓度升高而相应延长；且随着溶液浓度递增，发芽势和出苗率也依次下降，并明显的抑制了幼苗生长。本试验中，我们也观察到了类似的现象，随着叠氮化钠浓度的升高，西瓜种子萌发时间明显延迟，2个对照在第2 d时胚根已有5 mm左右，而当NaN3浓度为2.0 mmol/L时，胚根在前4 d基本没有伸长，到第6 d时胚根伸长也仅仅只有1.5 mm。当NaN3浓度变为2.0 mmol/L时，伊选的发芽率和成苗率则分别骤降到30.0%和33.3%。相对1.5 mmol/L，发芽率和成苗率同比分别下降47.1%和70%，其发芽时间和子叶开展时间也相应延后。1.5 mmol/L处理和2.0 mmol/L处理，分别使再生频率降低到40.0%和33.3%，每个外植体平均分化的不定芽数分别降低到4.3个和3.4个。与对照CK1和CK2的再生频率100%和每个外植体平均分化的不定芽数7.8个相比，差异极显著。

[1]张全美.西瓜高效植株再生体系建立及四倍体离体诱导研究[D].杭州：浙江大学，2004.

[2]郑蔚虹，张东向，张晓兵，等.磷酸缓冲液浸种对番茄幼苗抗冷性的影响[J].齐齐哈尔师范学院学报：自然科学版，1997，17（3）：53－55.

[3]张兰，孙建设，刘国荣.NaN3在苹果砧木组培苗诱变耐盐筛选中的应用[J].河北农业大学学报，2002（25）：108-110.

[4]张超美.叠氮化钠对小麦的诱变效应[J].湖北农学院学报，1994，14（3）：56－60．

Study on the Direct Regeneration System of Watermelon under the Treatment of NaN3

YANG Guozhi1,ZHANG Mingfang2,GU Zhanggen1,GOU Yanxia3
(1.Jiaxing Academy of Agricultural Sciences,Zhejiang 314016;2.Department of Horticulture,Zhejiang University; 3.Huhehaote Vocational Technical College)

Pure watermelon inbred line"Yixuan"was used in this experiment,the effects of NaN3on the direct regeneration system of watermelon was studied.The results showed that with the increase of NaN3concentration,the time of germination,radicle elongation,cotyledon extending,adventitious bud differentiation and elongation,and root regeneration was deferred distinctly;the percentage of adventitious bud differentiation and the ratio of adventitious bud differentiation per explant was lowered too.The best concentration for inducing chilling resistant mutant in"Yixuan"was 1.5 mmol/L,which decreased the frequency of explant regeneration to 40.0%,and the adventitious buds per explant to 4.3.It is accorded with the requirement ofLD50for chilling resistant mutant.

Chemical mutagenesis;NaN3;Adventitious bud differentiation;LD50

10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.06.004

杨国志（1979-），男，硕士，主要从事西瓜、甜瓜育种研究，电话：13957346489。E-mail:gzhyang99@126.com

2009-02-03