中药芪红合剂对肾间质纤维化模型大鼠肾组织中ＰＡＩ－１表达的影响

董华玲　马　华

[摘要]目的：探讨中药芪红合剂对肾间质纤维化模型大鼠肾组织中纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）表达的影响，及其对肾间质纤维化的作用机制。方法：采用单侧输尿管结扎(UUO)致肾间质纤维化的动物模型， 40只雄性Wistar大鼠随机分为4组：假手术组（A组）、手术模型组（B组）、芪红合剂组（C组）、依那普利组（D组）。术后14 d处死各组大鼠，收集血清、测定血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平，取结扎侧肾组织分别用HE、Masson染色，采用免疫组化检测肾组织中纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的表达，并用计算机图像分析系统进行分析。结果：模型组大鼠肾组织中PAI-1的表达较假手术组显著升高，两治疗组较模型组明显降低。模型组大鼠血肌酐、尿素氮水平较假手术组明显增高，两治疗组较模型组显著下降。结论：中药芪红合剂可降低大鼠血尿素氮、血肌酐水平，并可通过抑制纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的表达，而起到减轻肾间质纤维化病变程度的作用，推测其抑制PAI-1表达上调的作用可能是其抗肾间质纤维化的作用机制之一。

[关键词] 单侧输尿管结扎；肾间质纤维化；芪红合剂；纤溶酶原激活物抑制剂-1

[中图分类号] R285.6 [文献标识码]B [文章编号]1674-4721（2009）01（a）-043-03

The effect of Astragalus and Safflower mixture on expression of tissue inhibitors of motalloprotenase in renal tubulointerstitial fibrosis in rats with Unilateral Ureteral Obstruction

DONG Hua-ling1,MA Hua2

(1.Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan 030024,China; 2.The Second Hospital of Shanxi Medicine University,Taiyuan 030024,China)

[Abstract] Objective: To observe the effect of Astragalus and Safflower mixture on the expression of PAI-1 in rats with Unilatreal Ureteral Obstruction. To investigate the theraputic effects and its mechanisms of Astragalus and Safflower mixture.Methods: Rat renal interstitial fibrosis model was produced by unilateral ureteral obstruction,40 Wistar male rats were randomly divided into four groups: sham group(A group),UUO group(B group), A&S group(C group) and ACEI group(Dgroup). Sera and kidney tissues were collected from each group on the forteenth day.Bun and Scr were measured.It was carried out to measure the level of tubulointerstitial damage by Masson staining. The expression of PAI-1 in kidneys was analyzed by immunohistochemical method. Results: The expression of PAI-1 and the renal interstitial fibrotic area were highter significantly than that in sham group. Compared with UUO group, those of the treatment groups decreased markedly. The level of BUN and Scr in UUO group were significantly highter than that in sham group.Compared with UUO group,the level of BUN and Scr in treatment groups were significantly lower. Conclusion: Astragalus and Safflower mixture can downregulate the level of BUN and Scr in UUO animal model rats, Astragalus and Safflower mixture can suppress the upregulation of PAI-1 expression in kidneys of UUO animal model rats and decrease their interstitial fibrotic area.It is inferred that it may be one of the mechanisms of Astragalus and Safflower mixture suppressing renal tubular damage and interstitial fibrosis.

[Key words] Unilateral Ureteral Obstruction；Renal tubulointerstitial fibrosis； Astragalus and Safflower mixture； Plasminogen activator inhibitor 1.

肾间质纤维化是多种慢性肾脏疾病长期迁延所致，是最终导致慢性肾功能衰竭的主要病理基础，它以肾小管损伤、肾间质炎细胞浸润、纤维化为特征[1]。

芪红合剂是在长期的临床实践中总结出的治疗肾脏疾病的经验方，在我们的前期研究中，芪红合剂对单侧输尿管结扎致肾间质纤维化大鼠模型肾组织的病变程度有一定改善，并可减少结缔组织生长因子（CTGF）和基质金属蛋白组织抑制1（TIMP-1）在肾组织中的表达，本课题旨在研究芪红合剂对纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）表达的影响，进一步探讨芪红合剂在肾间质纤维化中的作用及可能的作用机制，为临床用药提供可靠的理论和实验依据。

1材料和方法

1．1实验药物、试剂

1.1.1 芪红合剂由黄芪、红花、大黄、水蛭等组成，按比例称取后，由山西医科大学第二医院中药制剂室煎制，每毫升药液中含生药3.7 g。

1.1.2依那普利佛山雅来制药有限公司提供，5 mg/粒

1.1.3主要试剂纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1) 免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 动物分组和造模雄性Wistar大鼠40只（由山西医科大学动物实验中心提供，二级），体重（150±3） g。常规饲养7 d后，随机分为4组：正常对照组（A组）、手术模型组（B组）、芪红合剂组（C组）、依那普利组（D组），每组10只。采用单侧输尿管结扎致肾间质纤维化大鼠模型（UUO），模型制备方法参考文献[2]。术前3 d开始灌胃给药，假手术组、手术模型组正常进水进食，中药治疗组每天给予芪红合剂2 ml/只，西药治疗组按10 mg/kg给予依那普利，每天1次。手术后第14天以10%水合氯醛0.03 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，从腹主动脉采血，分离血清，用于测定血生化指标；摘取左肾分别用10%中性甲醛和4%的多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，用于免疫组化分析。

1.2.2 观察指标

1.2.2.1 血生化指标的检测血尿素氮(BUN)采用二乙酰一肟法、血肌酐(Scr)采用苦味酸不除蛋白法测定。

1.2.2.2 肾组织病理观察石蜡包埋切片，行HE和Masson染色。光镜下观察肾小管及间质的结构及变化。Masson染色在400倍光镜下观察肾间质胶原纤维染色，每组选取8张切片，每张切片选取不重复的8个视野。采用BI2 000医学图像分析系统进行半定量分析，计算肾间质Masson染色阳性面积及阳性面积占整个视野百分比。

1.2.2.3 肾组织PAI-1免疫组织化学观察肾组织中PAI-1免疫组化采用SABC法，采用BI2000医学图像分析系统，在400倍光镜下测量每个显示屏的阳性染色面积和染色强度(平均光密度)。每组选取8张切片，每张切片测量8个视野进行半定量分析。

1.2.3 统计学方法

所有数据采用SPSS11.0软件处理，结果均以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两间比较采用SNK-q检验。

2结果

2.1 肾功能检测结果

模型组尿素氮和血肌酐均较假手术组升高，两治疗组较模型组呈下降，提示中药芪红合剂及依那普利均能降低梗阻性实验大鼠血尿素氮、血肌酐水平。见表1。

2.2肾脏病理观察结果

肉眼观察可见：假手术组肾脏大小形态正常，颜色暗红，模型组结扎侧肾脏体积明显肿大，内含混浊尿液，颜色变浅，肾实质变薄，肾盂扩张。

光镜下HE染色结果：假手术组肾脏组织结构正常，肾小管排列紧密、整齐；手术模型组可见肾小管排列紊乱，弥漫的肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性，多数肾小管扩张、部分萎缩，偶见坏死，肾间质增宽，肾小管间质中有炎症细胞浸润和间质纤维化，治疗组上述改变均较模型组减轻。

Masson染色示：假手术组肾脏有胶原染色主要位于肾小球基膜、Bowman囊、系膜区和肾小管的毛细血管周围；模型组可见肾间质增宽，大量胶原纤维增生，间质胶原纤维呈蓝色染色，间质纤维化呈灶状分布，肾小球病变不明显，治疗组上述改变均有所减轻。结果见表2。

2.3肾组织中PAI-1的免疫组化分析

假手术组大鼠肾小管上皮细胞胞浆有少量PAI-1表达，肾小球和肾间质细胞少见PAI-1表达。模型组可见PAI-1表达较假手术组明显增强，主要在皮髓交界的肾小管间质区以及肾小管上皮细胞表达明显。治疗组较模型组表达明显减弱，但仍未达到假手术组水平。结果见表3。

3讨论

肾间质纤维化是各种原因造成的肾小管及间质病变的最终结果，也是导致终末期肾衰的主要原因之一。细胞外基质（ECM）的大量沉积是肾间质纤维化形成的主要机制[3]。现已证实ECM的降解减少是引起ECM积聚的主要原因[4]。

调节ECM降解主要为凝血纤溶系统和基质金属蛋白酶系统，其中尤以凝血纤溶系统更为重要。已知纤溶系统在组织重塑、血栓溶解、基质降解中具有重要作用，纤溶酶除可直接降解ECM，还可促进基质金属蛋白酶家族的表达上调[5]。纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）是纤溶酶原激活物（PA）的生理性特异抑制物，现已发现四种不同类型的PAI(PAI-1、PAI-2、PAI-3、PAI-4)，均有抑制PA的作用，其中PAI-1是PAI的主要形式，也是PA最重要的抑制剂，能抑制PA对纤溶酶原的活化，从而抑制纤维蛋白水解和ECM降解，导致组织器官硬化、纤维化。马宏[6]等通过对肾病大鼠肾组织中尿激酶纤溶酶原激活物及其抑制物表过特点的研究发现，在肾病大鼠的肾组织中PAI-1表达上调；Ishidoya[7]等用RT-PCR和免疫组化的方法，在梗阻后1~10 d，发现梗阻肾中PAI-1mRNA的表达明显上调，而对照组肾组织中的PAI-1mRNA无明显变化。这些研究都表明PAI-1的表达上调在肾间质纤维化中起着重要作用。

肾间质纤维化在中医属于“水肿”、“癃闭”、“关格” 等疾病的范畴。结合现代医学微观发病机制，根据中医“久病多虚”、“久病入络”、“病久多瘀”的理论，我们认为本病属于中医气虚血瘀、痰瘀互结、蕴久化毒为害所致。在长期临床实践中，根据病症结合、整体调节的理论，对各种慢性肾脏疾病运用扶正活血、化瘀通络之法，选用基础方芪红合剂进行辨证治疗，能够有效的改善患者的临床症状，延缓病情的进展，提高患者的生存质量。

芪红合剂是以黄芪、红花、大黄、水蛭等为主组成，方中黄芪扶正固本，现代药理研究证实有显著的免疫调节活性和抗氧化作用，可通过对多种细胞因子的调节作用，减少蛋白尿，保护肾脏。黄芪药物血清能抑制PAI-1基因表达的上调，达到抗纤维化作用[8-9]。红花、水蛭活血化瘀，有研究发现红花对损伤的肾小管上皮细胞具有保护作用[10]，水蛭是经典的破血逐瘀药，其主要成分水蛭素是天然凝血酶拮抗剂，以水蛭为主药的复方可以下调5/6肾切除大鼠残肾中TGF-β1、PAI-1mRNA的表达，从而延缓肾小球硬化[11]。大黄解毒泻热，可抑制肾小球上皮细胞的肥大和增殖，抑制体内蛋白分解，降低血肌酐和尿素氮的生成[12]。同时大黄还可降低PAI-1活性，增加细胞外基质降解[13]。全方配伍可攻补兼施，攻邪而不伤正，扶正又不助邪，共奏益气活血、化瘀通络之效。

单侧输尿管梗阻是公认的肾间质纤维化的较好模型，可以导致严重的肾小管间质病变而肾小球不受影响，在本研究中观察到，梗阻后的大鼠肾组织中大量炎症细胞浸润，肾小管扩张，坏死，肾间质增宽以及间质纤维化。提示该模型制备成功。在研究中我们观察了纤溶酶原激活物抑制剂－1（PAI－1）在肾组织中的变化，我们发现中药芪红合剂和依那普利均可抑制PAI-1在UUO大鼠肾组织中表达的上调。提示中药芪红合剂可能通过抑制PAI-1在UUO大鼠肾组织中的表达，延缓肾小管损伤和肾间质纤维化的进展。

在本研究中我们发现中药芪红合剂与依那普利均可通过下调UUO术后大鼠的血肌酐和尿素氮水平，明显改善其肾功能，并可通过下调PAI-1在肾组织中的表达减轻肾小管损伤和间质纤维化，提示抑制PAI-1的表达上调是中药芪红合剂抗肾小管间质损伤的作用机制之一。

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（收稿日期：2008-12-18）