快速法检测生活饮用水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫结果分析

沈 强 朱莉勤 张梦寒 姜 韬

贾第鞭毛虫和隐孢子虫(合称两虫)都是原虫类寄生虫，其中可感染人的主要有肠贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫。由于贾第鞭毛虫和隐孢子虫的卵囊、孢囊的表面包裹着一层较厚的囊壁，因此，在环境中具有非常强的抵抗力。常规消毒工艺的氯浓度不能有效灭活隐孢子虫和贾第鞭毛虫，它们可通过水厂构筑物进入供水管网，威胁人们健康。美国环保总局1999年就开始对原水进行两虫的检测，中国卫生部在2006年12月29日发布的《生活饮用水卫生标准》(GB5749—2006)中增加了贾第鞭毛虫和隐孢子虫的微生物指标。要求：＜1个/10L水，规定两虫的回收率需≥10％。我们采用Filta-Max Xpress快速法检测两虫，现对结果进行分析。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器设备仪器设备有Masterflexmode 177601-10蠕动泵、Filta-Max xpress(tm)一过滤淘洗系统、Het-tieh Rotanta 460大容量离心机、Bead Retriever(tm)全自动微生物磁珠分选系统、德国Zeiss荧光显微镜、fiha-max xpress快速过滤模块、BeadRetriver试管和tip头、filta-max xpress取样和洗脱快速连接装置、filta-max xpress滤室。

1.1.2试剂实际有免疫磁分离试剂盒Dynabeads GC-Comb(挪威Dynal公司)、AIOOFLK.Aqua-Glo G/C荧光染色试剂盒、DAPI染色试剂。缓冲液：在容器中加入8g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄以及0.24g KH₂PO₄溶在0.9L的试剂级水中，调pH值至7.4，加0.1mL Tween 20溶液到容器中再搅拌10min，用纯水定容到1.0L。

1.1.3水样水样来源于本地自来水公司采集的50份原水和30份出厂水。

1.2方法

1.2.1过滤和淘洗因水样中的卵囊数量很少，因此需要浓缩较大体积的水样，一般原水取样20L，处理水100L。通过蠕动泵将过滤装置(filta-max xpress快速过滤器)连接到需采样的水源，进行过滤。每个样品准备400mL的缓冲液，打开500mL离心管的盖子，把它放在淘洗系统的离心管支架上，把分流装置连接到滤器上，把滤器连接到压力淘洗装置上，确保缓冲液已经放在缓冲池中，开始洗脱。洗脱结束将离心管盖上盖子从支架上取出进行下一步离心。

1.2.2离心浓缩将装有淘洗液样本的500mL离心管置于离心机2 000 g离心15min，慢慢地减速以免搅起沉淀物，记录沉淀物体积。

1.2.3免疫磁珠分离样品离心后吸出上清液，留3mL进行免疫磁珠分离。采用Bead Retriever(tm)全自动微生物磁珠分选系统将隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊分离出来，置于玻片上。

1.2.4染色镜检玻片放到42℃培养箱内蒸发干，然后用甲醇固定，静置3～5min，加入1滴A100 FLK.Aqua-Glo G/C两虫单克隆抗体染色剂染色和DAPI溶液染色，吸去玻片上多余染液，用PBS(pH 7.4)冲洗玻片，风干，计数并密封。用蓝色滤光片(激发波长490nm，发射波长510nm)检测FITC单抗标记的卵囊，放大倍数为200～400倍；DAPI染色用紫外光滤光片(激发波长400nm，发射波长420nm)放大200～400倍观察。

1.3计算

①水样中包囊/卵囊数(个/10L)：Y=(X×W)/(V×Z)×10

Y—每10L水样中包囊/卵囊的个数；X—玻片井内计数包囊/卵囊的个数；W—水样离心后沉淀物的体积；

V—免疫磁分离取沉淀物的体积；Z—过滤水样的总体积。

②Filta-Max xpress快速法回收率的测定：用超纯水加标的模拟水样对淘洗离心、免疫磁分离、染色计数3个阶段测定(重复4次，空白对照1次)。

贾第鞭毛虫/隐孢子虫回收率(％)=回收孢囊/卵囊个数×100％

2结果

2.1两虫检测结果

本次共检测原水50份，出厂水30份，其中原水中有1份检出贾第鞭毛虫值为2个/L。

2.2回收率

实验各阶段的加标回收率为4次平行实验的平均值，结果见表1。

3讨论

实验结果表明，淘洗离心阶段损失孢/卵囊数最多，有效提高回收率的措施为采用自动淘洗装置，离心减速设置勿用制动器，须慢慢减速，以免搅起沉淀物，实验操作中轻拿轻放离心管，吸出上清时的操作要熟练等。免疫磁分离阶段孢/卵囊数损失约为20％左右，分析原因，与免疫反应过程的温度和时间的控制，免疫磁珠和卵/孢囊抗原是否充分结合及其提纯程度，解离后卵/孢囊的转移操作技术等因素有关。染色计数阶段回收率的影响一是和免疫荧光染色试剂盒和DAPI染液的质量有关，所以应进行阳性对照和阴性对照的染色观察，二是计数误差，可采取多人同时计数以减少人为误差。

生活饮用水106项指标，按照要求2012年全部开展，目前由于两虫检测要求的仪器设备条件比较高，江苏省内疾控系统苏州还是第一家采用Filta-Max xpress(r)快速法进行两虫检测的单位。Filta-Max xpress(r)快速法虽然作为检测的第3种方法，但是在淘洗阶段全过程仅需2min，相对于Filta-Max法和Enviroehek HV法分析隐孢子虫和贾第鞭毛虫，Filta-Max xpress快速法将显著提高样品处理量，同时减少劳动量，有效提高回收率。我国现行的《生活饮用水标准检验方法》GB/T 5750—2006中规定两虫的回收率需≥10％，本方法的平均回收率都超过了35％，表明本实验室的技术成熟，该方法所使用的设备功能正常，试剂有效。Fiha-Max xpress快速法可广泛应用于各种水质的两虫检测。