高效液相色谱法测定珍黄片的含量

白玉红　郑清娉　胡克菲

[摘要] 目的:建立高效液相色谱法测定珍黄片的含量。方法:采用高效液相色谱法对制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量进行测定。结果:人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的线性范围分别为1.144～11.440 μg(r=0.999 9)、0.948～9.480 μg(r=0.999 9)和0.434～4.340 μg(r=0.999 8),平均回收率分别为96.46%(RSD=1.01%)、98.17%(RSD=1.02%)和96.27%(RSD=1.16%)。结论: 该方法简便、灵敏、准确,适用于珍黄片的含量测定。

[关键词] 珍黄片;含量测定;高效液相色谱

[中图分类号]R927.2[文献标识码]B [文章编号]1674-4721(2009)07(a)-134-02

珍黄片由珍珠、牛黄、三七、黄芩提取物、冰片、猪胆汁等组成,具有清热解毒,消肿止痛的功效,主要用于咽喉肿痛,疮疡热疖[1]。为了更好地控制其质量,保证临床用药安全有效,本实验采用了HPLC法测定了制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[2-5],方法简便、准确、可靠。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-2010高效液相色谱仪,Intersil C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)。

1.2 试药

人参皂苷Rg1对照品(Ⅰ)(供含量测定用,批号:0703-9812)、人参皂苷Rb1对照品(Ⅱ)(供含量测定用,批号:110704-200217)、三七皂苷R1对照品(Ⅲ)(供含量测定用,批号:0745-200006)(中国药品生物制品检定所提供);珍黄片(北京因科瑞斯生物制品研究所提供);乙腈为色谱纯,水为高纯水,其余试剂均为分析纯。

2 定量分析

2.1 色谱条件

Intersil C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱见表1,检测波长203 nm,流速1.5 ml/min,柱温30 ℃,进样量10 μl,理论板数按Ⅲ峰计算应不低于2 000。在该色谱条件下,样品中被测成分能够达到基线分离,保留时间在15 min内,阴性无干扰,色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ对照品适量,加甲醇制成每1 ml含Ⅰ0.55 mg、Ⅱ0.45 mg和Ⅲ0.20 mg的混合溶液,即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品细粉适量(约1.5 g),精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 ml,称定重量,加热回流提取2 h,放冷,用甲醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液25 ml,蒸干,残渣加1%氢氧化钠50 ml,分次溶解并移入分液漏斗中,用水饱和的正丁醇振摇提取5次(分别为30,30,20,20,20 ml),合并正丁醇液,用正丁醇饱和的水洗涤至中性,每次25 ml,正丁醇液另器贮存,合并水液,用水饱和的正丁醇30 ml振摇提取,醇液与上述正丁醇液合并,蒸干,残渣加乙醚5 ml洗涤,弃去乙醚液,残渣挥尽乙醚,加甲醇溶解,并移至10 ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

按珍黄片处方,除去三七药材,制备阴性对照样品。按“供试品溶液的制备”项制备阴性样品溶液。

2.5 线性关系考察

分别精密称取Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ对照品适量,加甲醇溶解并稀释,制得浓度分别为1.144 mg/ml、0. 948 mg/ml和0.434 mg/ml的对照品溶液。分别精密吸取该溶液1、2、5、7、10 ml,置于10 ml的容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,各进样10 μl,连续进样2次,按上述色谱条件测定峰面积。以对照品进样量(X)为横坐标,色谱峰峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,回归方程见表2。

2.6 精密度试验

取同一批供试品溶液,在上述色谱条件下连续进样5次,各样品峰面积的RSD分别为:Ⅰ1.38%,Ⅱ1.11%,Ⅲ1.96%,表明精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一批供试品溶液,在上述色谱条件下,分别于0,2,4,8,12,24 h测定,各样品在24 h内峰面积的RSD分别为:Ⅰ0.69%,Ⅱ1.00%,Ⅲ1.88%,表明样品在24 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

取同一批样品,按拟定的方法平行测定6份,平均含量为Ⅰ8.21 mg/g,Ⅱ7.21 mg/g,Ⅲ1.97 mg/g,RSD分别为:Ⅰ0.82%,Ⅱ1.82%,Ⅲ1.91%,表明该方法的重复性较好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品6份,各加入一定量的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,在上述色谱条件下测定,计算回收率,平均回收率分别为Ⅰ96.46%,Ⅱ98.17%,Ⅲ96.27%,RSD分别为:Ⅰ1.01%Ⅱ1.02%,Ⅲ1.06%

2.10 样品测定

取五批样品(批号:20041019、20041122、20050303、20050601、20050605),分别按“供试品溶液的制备”项制备供试品溶液,准确吸取供试液10 μl,在上述色谱条件下测定,总含量(mg/g)分别为5.11、5.14、5.14、5.11、5.16。

3 讨论

3.1 流动相的选择

通过参考有关文献,测定三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的流动相多为乙腈-水梯度洗脱。经试验,采用文中流动相,对照品及供试品溶液中各色谱峰均能达到基线分离,效果良好。

3.2 检测波长的选择

取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1对照品,加甲醇分别制成20、30、50 μg/ml的溶液,用紫外可见分光光度仪分别进行200～400 nm波长的扫描,可见人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1均在203 nm处有最大吸收峰,故选择203 nm作为检测波长。

本文提出的 HPLC法能简便、灵敏、准确地测定珍黄片的含量,能满足质量控制需要。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2000:248.

[2]宋崇顺.清热解毒药与泻火药相配伍的实验研究[J].中国中药杂志,1995,20(4):243-246.

[3]邵爱新.薄层扫描测定清热解毒口服液中栀子苷的含量[J].药物分析杂志,1991,11(3): 150-152.

[4]董建萍.对清热解毒口服液质量标准的探讨[J].中国药品标准,2002,3(6):41-42.

[5]谢沐峰.高效液相色谱法测定含量时关于确定色谱条件与溶液浓度的讨论[J].中国药品标准,2008,9(4):288-289.

(收稿日期:2009-04-29)