力竭运动后２４ｈ大鼠肾组织ＮＯ含量的变化

刘祥梅　吴宇强　严　秋　唐瑶函　谭　军

（湖南师范大学体育学院，湖南 长沙 410012）

摘 要：为探讨力竭运动后恢复24 h肾脏NO含量变化特点与肾损伤程度关系，将24只SD大鼠随机分为安静对照组（C）、低强度力竭组（LE）和高强度力竭组（HE）。一次性跑台力竭运动后24 h取材，检测肾组织NO含量、NOS活性和血清尿素氮、血清肌酐、尿蛋白含量，透射电镜观察肾细胞凋亡等病理变化。结果表明：HE组的肾组织NO含量和NOS活性明显低于LE组（ P <0.05～0.01）；HE组的血清尿素氮、血清肌酐和尿蛋白含量明显异常（ P <0.05～0.01），LE组仅血清尿素氮浓度明显异常（ P <0.05）；透射电镜下两运动组的肾小管上皮细胞线粒体损害, 且HE组的肾实质细胞凋亡显著增加（ P <0.05）和偶见坏死。结论：强度不同的力竭运动恢复24 h，大鼠肾组织的NO含量变化趋势不同，高强度力竭运动后肾实质细胞损伤、肾功能恢复缓慢与肾组织的NO含量水平降低有关。

关键词：力竭运动；肾；NO；NOS；大鼠

中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)10-1375-04

Changes of Nitric Oxide Content in Rat's Kidney at 24 Hours after Exhaustive Exercise

LIU Xiang-mei, WU Yu-qiang, YAN Qiu, TANG Yao-han, TAN Jun

(College of Physical Education Science, Hunan Normal University, Changsha 410012, Hunan China)

Abstract:To studythe relation between change character of nitric oxide and lesion in kidney at 24 hours after exhaustive exercise, 24 male SD rats are randomly divided into quite control group (C), low intensity exhaustive exercise group (LE) and high intensity exhaustive exercise group(HE). After 24 hours once exhaustive exercise the concentrations of nitric oxide in kidney, serum urea nitrogen, serum creatinine, urinary protein and nitric oxide synthase activity are determined. Renal cells are observed with electron microscope. The results show that the concentrations of nitric oxide and nitric oxide synthase activity in rats' kidney of HE group are higher than these in LE group( P <0.05～0.01). The concentrations of serum urea nitrogen, serum creatinine and urinary protein are abnormal obviously in HE group ( P <0.05～0.01). The concentrations of serum urea nitrogen are only abnormal obviously in HE group ( P <0.05). The mitochondrials of renal tubular epithelial cells are injured in LE and HE groups. But renal cell apoptosis increases significantly ( P <0.05) and necrosis can be observed occasionally in HE group. Conclusion: when exercises intensity are difference the changing trend of nitric oxide concentrations in kidney are various. The renal cell injured and renal function lowed have relation to decrease the concentrations of nitric oxide at 24 hours after high intensity exhaustive exercise.

Key words: exhaustive exercise; kidney; nitric oxide; nitric oxide synthase; rat

一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是生物机体内一种具有重要生理活性的小分子物质，在肾脏正常功能维持中作用重要，其含量异常变化可造成肾组织结构和功能损害^[1-2]。运动引起机体内多系统器官的NO含量变化，并对其组织结构和功能产生影响^[3-5]。田振军发现大强度运动肾脏皮质区一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）含量增高，认为其促进大鼠肾脏皮质区细胞凋亡和NO大量生成有关^[6]。但低强度耐力训练再力竭运动恢复24 h，大鼠肾组织NO含量变化不明显^[7]。力竭运动损伤肾的组织结构和功能，强度不同的力竭运动恢复24 h肾脏NO含量变化特点与肾损伤程度的关系不明，本实验对两种不同强度一次性力竭运动后24 h大鼠进行研究，为运动性肾损伤机制丰富实验资料和理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物及分组 ┆健康雄性的SD大鼠，8周龄，体重(180～220)g，由湖南农学院实验动物中心提供。静养与观察3 d，在速度为10 m/min、坡度为0°的跑台上进行适应性跑15 min，筛选出24只能完成跑的大鼠，按体重分层随机分为安静对照组（C）、低强度力竭组（LE）和高强度力竭组（HE），每组8只。

1.2 运动方式 ┆狢组不进行运动，LE和HE组于杭州立泰科技有限公司提供的PT动物实验跑台上进行坡度为0°的一次性力竭运动。LE组按18 m/min和20 m/min的速度各跑10 min，接着22 m/min和24 m/min的速度各跑15 min，最后稳定在26 m/min的速度跑至力竭。HE组按18 m/min 、22 m/min 的速度各跑10 min，接着26 m/min 、30 m/min 的速度各跑15 min，最后稳定在34 m/min的速度跑至力竭。力竭标准：电刺激大鼠尾部，仍跟不上预定速度，臀部压在跑台后壁，经电刺激仍无力运动，后肢随转动皮带后拖达30 s，取出放在平台上

投稿日期：2007-06-20

基金项目：湖南省自然科学基金（05JJ40114）及湖南省体育科学会重点项目（06-028）。

作者简介：刘祥梅，副教授，研究方向体育保健学、中医养生。)也无力走动,视为力竭。

1.3 取材方法 ┆大鼠力竭运动后24 h，采用2%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射，麻醉后断头处死，颈部取血、离心取血清。剖开腹腔，用4号针头及微量注射器从膀胱抽取尿液，摘取肾脏。在冰冷的生理盐水中漂洗干净，滤纸吸干水分，冰面上右肾纵行剖开，在肾上端切取1 cm×1 cm×4 mm皮质组织浸入2.5%的戊二醛，余下皮质组织投入液氮。C组做相同处理。

1.4 肾组织一氧化氮生成和肾功能指标检测 ┆取约0.1 ｇ肾皮质入9倍重量的生理盐水，用电动匀浆器制备成10%的匀浆，离心取上清液立刻用硝酸还原酶法测定NO浓度，测定单位重量组织蛋白质单位时间内生成NO的nmol数反映NOS活性，考马斯亮蓝法测定组织蛋白质含量。二乙酰一肟比色法测定血清尿素氮浓度，苦味酸比色法检测血清肌酐，双缩脲法检测尿蛋白含量。检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，方法与操作完全按试剂盒说明进行。

1.5 大鼠肾细胞的电镜检测 ┆2.5%戊二醛溶液中固定24 h的肾皮质,用2%锇酸后固定2 h，经50%、70%、90%、100%的丙酮梯度脱水,每级10 min×3次。37℃的环氧树脂与纯丙酮（1：1）混合液浸泡24 h，用Epon812 (Epoxiaquivalentgewicht 145-160)、 DDSA (Dodecenylsuccinic Anhydride)、 MNA(Methy1 Nadic Anhydride)、 DMP30 (Dimethylaminomethyt Phenol)，60℃，24 h包埋成块。用瑞典产LKB-Ⅲ型切片机超薄切片,经醋酸铀和硝酸铅双重染色后用日本产H-600型透射电镜观察。并分别对每张切片中肾小管和肾小球各15个连续不重叠视野中的凋亡细胞数记录，计算各组肾小管和肾小球每视野凋亡细胞平均数。检测由湖南医科大学电镜室完成。

1.6 统计学分析 所有数值以平均数±标准差（ X±S ）表示。实验数据处理使用SPSS for Windows 11.5统计软件，采用One-Way ANOVA分析比较。 以P<0.05作为差异显著性水平，P<0.01为差异非常显著性水平。

2 结 果

力竭运动时间LE组(276.75±54.03)min，HE组(130.50±41.52)min，LE组显著长于HE组2.1 肾组织NO含量和NOS活性变化 与C组比较，肾组织的NO含量LE组呈升高趋势、HE组呈降低趋势，差异均不具统计学意义（ P <0.05），HE组显著低于LE组（ P <0.01）。NOS活性LE组有高于C组趋势，但差异不显著（ P <0.05），HE组低于C组和LE组，差异显著（ P <0.05）（表1）。

表1 各实验组大鼠肾组织的NO含量和NOS活性比较

2.2 肾功能检测结果 ┆力竭运动后恢复24 h与C组比较，HE和LE组的尿蛋白含量、血清尿素氮及肌酐的浓度都呈增高趋势，HE组增高明显（ P <0.05～0.01），尿蛋白含量HE组还显著高于LE组（ P <0.05），LE组仅血清肌酐浓度显著高于C组（ P <0.05）（表2）。

表2 各实验组大鼠尿蛋白含量、血清尿素氮和

常，偶见肾实质细胞凋亡。LE组肾小管上皮细胞线粒体空泡变较多、凋亡少，偶见肾小球系膜细胞和足突细胞凋亡。HE组肾小管上皮细胞胞浆水肿、线立体肿胀和空泡化，微绒毛稀少或消失，有较多凋亡和偶见坏死，肾小球足突细胞、系膜细胞和血管内皮细胞凋亡均有所增多。平均每视野肾实质凋亡细胞数两运动组呈高于C组趋势，LE组差异不显著（ P <0.05），HE组肾小管凋亡细胞显著高于C组和LE组（ P <0.05）（图1～2，表3）。

图1 大鼠肾小管细胞电镜检测结果图2 大鼠肾小球细胞电镜检测结果表3 各组大鼠肾实质细胞凋亡情况比较

（个/平均每视野 X±S ）

组别肾小管肾小球安静对照组（C）0.40±0.520.27±0.47低强度力竭组（LE）0.52±0.420.603 讨 论

Kone BC和Mattson DL均证实，肾脏皮髓质内均分布有合成NO的关键酶NOS，因此肾脏是具有产生NO能力的器官，生理状况下肾组织内合适的NO浓度对维持正常肾脏血液灌注和肾小球滤过作用重要^[8，9]。在肾脏病理损伤中，NOS缺乏或过表达及活性变化，引起NO含量过高或过低是重要因素之一^[1，9～11]。国内外许多研究反映运动引起机体内NO含量变化，并对组织器官的影响和作用复杂。很多学者一致认为，运动导致的NO增高对机体产生正负两方面影响：1）作为舒张血管因子，利于降低血管阻力增加各系统器官血流量，保证氧和营养物质供给及代谢产物清除；降低心肌耗氧量和提高葡萄糖转运入骨骼肌的速率，维持运动中高水平心功能和促进葡萄糖利用^[12]。2）过多的NO具有毒性作用，可能与O²形成ONOO-，氧化损伤蛋白质、脂肪酸、核酸，攻击DNA，破坏线粒体的完整，导致细胞凋亡等损害现象^[3，6]。

本实验显示，高低强度不同的跑台力竭运动后恢复24 h，大鼠肾组织的NOS活性和NO含量变化趋势却不同，低强度力竭后趋向升高，大强度力竭后趋向降低，两组间差异十分显著。继往大多数研究认为一次性运动引起机体NO含量水平增高，而有关一次性力竭运动机体不同组织和同一组织NO含量变化的研究结果报道差异较大。 Chirpaz报道递增负荷65%以上最大摄氧量的力竭性跑步呼出气NO浓度降低^[13]。胡旺平报道，大鼠一次性力竭游泳后海马NOS和NO含量显著升高，对海马神经元损伤^[4]。赵敬国发现大鼠力竭游泳后胃内NO含量显著增加、NOS活性显著增强，认为这可能是胃黏膜对运动应激的抵抗，另一方面又诱发运动应激溃疡^[14]。张全江报道小鼠一次性游泳至力竭即刻肝脏NO含量显著下降，骨骼肌和血清NO含量显著上升；恢复24 h后，肝脏NO含量显著上升，骨骼肌和血清NO含量显著下降，认为运动促进组织NO生成，同时与运动中血流变化趋势有关^[15]。许云霞发现训练小鼠力竭运动后即刻骨骼肌NO含量迅速降低，恢复24 h达到锋值^[16]。而本研究中不同强度力竭运动后24 h肾组织的NO含量变化差异明显，与前述研究有类同与区别，重要的是反映了运动强度是导致力竭运动恢复期肾组织NO含量变化的关键因素。肾脏严重缺血再灌注使NOS活性降低，NO生成可减少^[17]。本实验结果可能因高强度力竭运动对机体刺激过于强烈，肾组织严重缺血缺氧，力竭运动后24 h影响NO含量降低的多因素持续存在导致：1)机体内环境明显酸化，NO合成关键限速因子NOS活性仍受抑制。2)高强度力竭运动使机体内Ｌ-精氨酸分解加速^[18]，合成NO的底物减少，恢复缓慢，原料不足。3)高强度力竭运动后24 h内无法彻底清除产生过多的自由基，氧自由基使NO生物活性丧失^[19]。4）使血管强烈收缩的血管内皮素在运动中分泌增高，强度越大升高幅度越大^[20]，高强度力竭运动中及恢复期，NO拮抗其过高分泌实现舒张血管过程中大量损耗。而低强度力竭运动因强度低，对机体刺激相对轻缓，缺血再灌注和以上变化幅度低，机体恢复24 h后影响因素消除速度快于大强度力竭运动，且能发生调节保护过程，从而NO含量适度上升。

Manukhina 认为适宜运动增高包括肾脏在内的等内脏器官NOS和NO含量水平，可以对抗血管内皮素分泌失调保护内脏^[3]。多数学者认为NO的舒张血管作用在运动中可能不是决定性的，但在恢复期作用重要，徐建方曾用补充L-Arg的方法，证明NO有利于提高机体的恢复潜力^[21]。肾皮质血管是肾血流动力学、电解质平衡和NO依赖性调节和维持的主要部位，肾组织NO含量高低变化，对肾皮质血流量影响明显。吴雄飞应用NO供体直接提供外源性NO，提高肾内NO水平，证实可以有效增加肾缺血再灌注后血流，改善肾功能^[22]。基于以上实验和观点，高强度力竭运动恢复24 h肾组织NO含量减少，肾皮质血流量不足，对肾脏的结构和功能有害。低强度力竭后24 h肾组织NO含量适量增高，利于肾皮质血流量增加降低缺血损伤，肾的组织结构和功能修复速度较快。但这限于理论推测，需要事实验证。本试验中相应时段的肾功能指标检测显示，大强度力竭后肾组织NO含量偏低的同时，三项肾功能指标均显著异常，而低强度力竭组NO基础值适度增高的同时，仅血清尿素氮浓度明显异常，肾功能指标明显优于大强度组。反应力竭运动后恢复24 h的肾功能确实因运动强度大小差异而有损伤程度高低、恢复速度快慢的区别，并与肾脏NO含量水平高低变化不同关系密切。

在急慢性肾损害中肾实质细胞可能发生多种病理学改变，异常增加的细胞凋亡是肾损伤重要形式之一，NO含量增高的毒性作用或降低后组织血流量减少都是重要原因。如刘红燕报道，高脂饮食导致肾细胞凋亡与肾皮质NO含量增多、NOS表达增强有关^[23]；李树全对阿霉素肾病研究，证明NO水平的减少导致肾细胞凋亡增加，认为涉及到血管内皮素增加、血管收缩，使肾脏出现病理损伤^[11]。大强度或长时间运动作为一种有害因素对肾损伤，包含了多种病理形式。袁海平报道大鼠大强度运动后尿蛋白浓度显著增加，同时肾脏组织细胞凋亡增加，认为两者变化的一致性表明两者存在某种关系^[24]。郭林认为一次性力竭运动后特别是恢复期内尿蛋白排泄增加，关键是肾脏超微结构受自由基损害，特别是肾小管发生急性损伤^[25]。关于NO含量高低变化与运动性肾损害病理形式，田振军认为大强度运动促进肾脏皮质细胞凋亡与NO大量生成有关^[6]。本实验中观察到，无论NO含量高低变化，力竭运动恢复24 大鼠的肾小管上皮细胞线粒体都有损害，肾实质细胞凋亡有所增加。但低强度组的变化程度低，与安静对照组差异不显著，大强度组凋亡显著增加且偶见坏死。说明力竭运动恢复期，NO含量降低在肾实质细胞损害各形式中扮演重要角色，尤其与肾细胞凋亡关系密切；NO含量的轻度上升却有利于阻止或减轻力竭运动导致的肾实质细胞各形式损伤。这一结果与田振军的研究具有差别，可能因运动方式和检测时段不同导致，其结果关键与NO含量变化影响肾组织血氧供应，肾脏缺血和再灌注损伤的变化有关，但具体机制有待进一步探讨。

4 小 结

1） 力竭运动恢复24 h大鼠肾组织的NOS活性和NO含量变化因强度不同而差异明显，低强度趋向升高，大强度趋向降低。

2） 运动强度不同导致大力竭运动后恢复24 h的肾功能损伤程度、恢复速度快慢有区别，与肾组织NO含量水平变化不同有关。适度的NO含量水平上升使肾功能指标优化。

3） 力竭运动恢复期的肾实质细胞损伤，肾皮质NO含量降低起促进作用，轻度上升可能有阻止或减轻效果。

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