间歇性负重游泳训练对大鼠杏仁基底外侧核（ＢＬＡ）ｃ－ｆｏｓ蛋白表达的影响
2008-11-17于芳张安民王根深汪晓阳
于 芳 张安民 王根深 汪晓阳
（1.中北大学运动人体科学实验中心，山西 太原 030051；2. 烟台大学体育学院，山东 烟台 264005；3.山西大学体育学院，山西 太原 030006）
摘 要：目的：观察间歇性负重游泳训练后大鼠杏仁基底外侧核（BLA）内c-fos蛋白表达的变化，探讨间歇性游泳训练对c-fos蛋白表达的诱导机制。方法：建立大鼠间歇性负重游泳训练模型，用ABC免疫组织化学方法检测训练后即刻、0.5、1 h、2 h、4 h大鼠BLA 内c-fos蛋白表达状况，并通过图像分析系统和统计学软件进行图像和数据分析。结果：对照组大鼠BLA 内c-fos阳性神经元少量散在分布；模型组明显增多，且随着时间的增长呈上升趋势（0.5 h＜1 h＜2 h），2 h达到峰值，与对照组相比具有非常显著性差异（ P ＜0.01）；然后逐渐下降。结论：间歇性负重游泳训练可引起大鼠BLA中c-fos蛋白表达上调，且具有一定的时效性，其机制可能与间歇运动能引起神经细胞内钙离子浓度变化有关。
关键词：间歇训练；杏仁基底外侧核；c-fos蛋白；大鼠
中图分类号：G804.5文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)10-1357-04
The Influence of Intermittent Swimming Exercise on the Expression of C-fos Protein in
Basolateral Nucleus of Rat Amygdale
YU Fang1, ZHANG An-ming2, WANG Geng-shen3, WANG Xiao-yang3
（1. Kinesiology Experiment Center, North University of China, Taiyuan 030051, Shanxi China; 2.College of Physical Education,
Yantai University, Yantai 264005,Shandong China; 3.College of Physical Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, Shanxi China）
Abstract:Objective To investigate the mechanism of the expression of c-fos protein by observing the changing tendency of c-fos protein in basolateral nucleus of rat amygdale (BLA) after intermittent swimming exercise. Methods: To establish the intermittent swimming exercise models, and detect the expression of c-fos protein in BLA at the moments of 0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h after exercise by immunohistochemical SABC method, then analyze the image and data by image analyzing system and statistic software. Results: Several Fos+ neurons of control group distribute in the BLA dispersively while the swimming groups express significantly higher, and increases progressively with time (0.5 h＜1 h＜2 h), the peak of Fos+ neurons happened at 2 h, and appears significant difference as compared with the control group ( P ＜0.01); then descends regularly. Conclusion: Intermittent swimming exercise raises the expression of c-fos protein in BLA，and has a certain timeliness. The mechanism has deal with the change of the intracellular calcium concentration at nerve cells.
Key words: intermittent exercise; basolateral nucleus of amygdale (BLA); c-fos protein; rat
大量研究表明，长期适宜运动训练可有效避免或延缓由于衰老而出现的神经系统各种症状和功能的退行性变化，促进神经元的再生[1～3]，还可诱导许多与神经活性、突触结构、神经可塑性等相关基因表达，有利于神经的生长、调节及保护，并对大脑皮层形态结构产生良好的影响，从而提高学习和记忆能力[4～7]。有学者认为，c-fos原癌基因参与了神经的生化和结构的长久变化，而这些变化是学习和记忆的基础[8]。c-fos原癌基因又称快反应基因或即刻早期基因，其特点是对细胞外刺激的快速诱导性，被认为是研究中枢神经系统最有代表性的即刻早期基因[9～10]，且其表达产物mRNA和核磷蛋白(P55c-fos ,简称Fos)位于神经元的胞浆或胞核内，是神经元兴奋水平的客观指标，人们常将其视作神经活性的转录因子和标志[11]。应激、针刺或给予神经肽等不同生理、心理刺激均可诱导c-fos的表达[12]。
运动作为一种特殊的应激源对c-fos蛋白表达有着显著的影响。近几年已有运动训练时脑内c-fos基因表达变化的报道，但具体到某一神经核团的研究少见。杏仁基底外侧核（basolateral amygdala ,BLA）是杏仁核最大的一个核群，分为外侧杏仁核、基底核、副基底核。BLA区含有大量的穿入与传出纤维，在情绪相关的学习和记忆中发挥重要作用[13]。我们采用SABC免疫组织化学的方法检测c-fos蛋白在大鼠BLA内的表达，来探讨间歇训练后不同时间点BLA内c-fos的表达规律及其产生机制，为运动训练及运动康复提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 雄性SD大鼠（山西医科大学实验动物中心提供）36只，健康3月龄，体重220～250 g。随机分为对照组（n=6只）、间歇运动组（n=30只）。标准啮齿类饲料饲养，自由饮水，活动自由。室温(20±5)℃，湿度45%±10%，光照每天14 ｈ。动物适应环境3 d，记录动物体重。
1.2 游泳训练模型
1.2.1 游泳条件 玻璃钢游泳池，游泳池规格为150 cm×70 cm×60 cm，水深60 cm，水温控制在(34±3)℃。
1.2.2 游泳方案 适应性游泳3 d，每天1次，时间依次为15 min、20 min、30 min，剔除不擅游泳者。随后开始正式游泳训练，每周训练6次，共训练6周。负重为体重5%，游泳6 min，休息4 min，每天连续进行10组。对照组不做任何运动，常规饲养，自由活动。
1.3 取材切片 造模结束后分即刻、0.5 h、1 h、2 h、4 h5个时刻取材。首先用0.2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物(35～50 mg/kg体重)，打开胸腔，从心尖将穿刺针插入至升主动脉，然后迅速剪破右心耳，并快速灌人400 mL预冷的生理盐水冲洗血管，随后用4％多聚甲醛200 mL快速灌注，接着放慢速度仍用4％多聚甲醛300 mL灌注，进行前固定，然后用10％蔗糖PBS灌入300 mL，至肝脏变硬变白为止。最后迅速断头，将头部放在冰盘上，打开颅腔，暴露全脑，取出放在4％多聚甲醛液内固定2 h，再浸入到20％蔗糖PBS液中4℃过夜，待组织块完全沉底后，用冰冻切片机连续冠状切片，隔4取1，片厚40 μm。实验仪器，采用TD-1508A轮转式冰冻切片机。
1.4 ABC免疫组织化学染色 兔抗大鼠c-fos多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；即用型SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。冰冻切片经室温平衡，水化后按以下步骤进行。脑组织切片入0.01 mol/L PBS液中漂洗5 min×3次，3%H2O2孵育10 min；5%封闭液封闭非特异性抗原1 h；加入1：250兔抗c-fos多克隆抗体37℃孵育5 h后4℃过夜。滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃条件下置湿盒内孵育40 min；滴加SABC，37℃孵育30 min；最后DAB显色20 min。上述步骤间0.01 mol/L PBS液中漂洗5 min×3次。然后置入0.2%明胶中裱片，风干后常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片剂封片。
阴性对照组：分别以正常兔血清和PBS代替第一抗体孵育，对照组未发现阳性物出现，即无特异性反应。
1.5 图像分析与统计学处理 ┆采用捷达801形态图像分析系统，对大鼠BLA中c-fos阳性神经元进行图像分析。每例动物取5张切片，在40×10倍光镜下计数每张切片双侧BLA中c-fos阳性神经元的数量。采用SPSS13.0统软件进行分析，数据以均值±标准差表示，显著性检验采用独立样本 t检验，以p <0.05为有统计学意义。
2 结 果
参照模式图（图1A、B）定位杏仁基底外侧核。光镜下观察，6周间歇性负重游泳训练后，大鼠BLA中c-fos免疫反应阳性神经元呈锥形和卵圆形，多数为大中型细胞。免疫反应产物呈棕褐色，低倍镜下为综色小原点，染色均匀，主要位于神经细胞核内，胞浆内也有部分表达，背底呈淡黄或不着色。图象分析和统计学处理结果如下（表1，图2～7）：ゼ湫运动结束后，模型组大鼠BLA中均可见数量不一的c-fos阳性细胞。正常对照组动物相应部位仅见零星的c-fos蛋白表达。间歇运动后即刻大鼠BLA中c-fos蛋白表达密度小，呈分散型，与对照组相比没有显著差异（ P ＞0.05）（图2、3）；间歇运动后大鼠BLA中c-fos蛋白表达随时间的延长呈上升趋势（0.5 h＜1 h＜2 h），2 h时大鼠BLA中c-fos蛋白表达达到峰值，与对照组相比具有非常显著性差异（ P ＜0.01）（图4～6）；然后随时间的延长大鼠BLA中c-fos蛋白表达开始下降，到了4 h时，c-fos蛋白表达明显减少，但仍然高于对照组，具有显著性差异（ P ＜0.05）（图7）。
表1 间歇性游泳训练后大鼠BLA内c-fos阳性
3 讨 论
c-fos原癌基因能迅速对神经递质、激素、神经冲动等外界刺激引起的传入信息作出反应，是神经活性的转录因子和标志[11]。在正常情况下，c-fos基因在神经系统的表达很低，参与细胞生长、繁殖、分化、信息传递和人的学习、记忆等生理过程。生理性刺激和病理情况下均能短暂地诱导细胞内c-fos基因的表达[12]。c-fos的转录激活在5 min即可发生，一般维持15～20 min，c-fosmRNA在刺激后30～45 min即可达到高峰。c-fos转录产生的成熟mRNA编码一个由380个氨基酸组成的，相对分子量为6.2×104的核酸蛋白，简称Fos，与另一即刻早期基因c-jun的表达产物形成异源二聚体复合物：转录因子AP-1（activator protein-1），参与信号传递系统中各效应酶的转录过程，调节其他多种基因的靶蛋白合成从而改变神经元的结构和功能[14]。目前，有人提出至少存在三种模式c-fos蛋白表达：1) 短暂而快速地表达；2) 延迟的持续性表达；3) 持续的组织特异性表达[15]。c-fos表达模式的不同对神经元的作用也具有很大差异，适度c-fos的表达能阻断细胞内信号的传导而产生一些死亡因子，细胞凋亡通路中有c-fos表达，表达与DNA损伤及修复有关，并参与细胞周期的调控，具有保护作用，但是不适当的过度表达可干预细胞核的修复功能，而导致细胞凋亡[16～17]。
近年来研究表明，运动作为一种特殊的应激源对c-fos表达有着显著的影响。跑轮运动和强制性游泳均能增加脑内c-fos基因表达[18～23]，Taeck-Hyun Lee等的研究发现，随着运动强度的增加，c-fos基因表达在大鼠海马各区的表达也随之明显增强，在第7 d达到最高值，然后又呈现出下降的趋势，他认为运动能够时间-强度依赖性的增强海马神经的活性，而c-fos基因表达继增加后减少，可能由于脑对应急刺激产生了适应性变化[19]。Oladehin等研究则显示，中等强度的有氧运动不仅能维持神经元的活性，而且在运动影响神经系统的过程中起到了调控因子的作用[23]。其作用机制可能与运动能激活c-fos表达的第二信使有关。目前的研究证实，参与c-fos基因激活的第二信使通路至少有三种：cAMP[24]、Ca2+［25]、甘油二脂依赖的蛋白激酶（PKC）[25]。适宜的运动可以引起脑内突触前膜多巴胺、5-HT等神经递质浓度增加[26]，这些递质作为细胞间传递信息的第一信使，作用于突触后膜的相关受体上，引起cAMP的产生，c-fos基因就含有cAMP反应序列CRE。另外，运动还可使胞内钙离子浓度升高，c-fos基因上端调控序列含有钙反元素（CaRE）转录调控元素，可调节c-fos蛋白表达。那么，极限强度的间歇运动会对大鼠BLA 中c-fos蛋白表达产生怎样的影响，其诱发机制可能是什么？正是我们本研究的目的。
杏仁核是边缘系统中重要的皮质下核团，其结构复杂，纤维联系和功能十分广泛，主要包括三个主要核群，杏仁中央核(CeA)、基底外侧核群(BLA)、皮质内侧核群(MeA)。其中杏仁基底外侧核BLA是杏仁核最大的一个核群（外侧杏仁核、基底核、副基底核），含有大量的穿入与传出纤维，在情绪相关的学习和记忆中发挥重要作用。杏仁核含有促肾上腺素释放因子（CRF）[27]，是参与应激的物质基础。电生理学研究发现，给予机体声音等外界刺激时，杏仁核部位的神经放电活动增强[28]。C.V. Dayas等研究发现，给予声音、免疫性应激刺激均会上调杏仁核部位c-fos基因的表达[29]。
在本研究中，大鼠经过6周间歇性负重游泳训练后，大鼠BLA中c-fos蛋白表达在各时间点均大于对照组，除即刻组外，其余各组与对照组均存在显著性差异( P <0.05)，说明间歇性负重游泳训练可引起大鼠BLA中c-fos蛋白表达增加。间歇训练法是一种极限强度并且严格控制运动和间歇时间的无氧训练方法，由于间歇期的存在，几乎在整个运动期均为最高强度的运动，并且能重复多次，因而在强度和量方面均保持高水平，在供能及生理反应特点上均严格区分于持续训练、静力训练甚至大强度衰竭性训练[30]。我们推测，间歇训练上调c-fos蛋白表达，可能与胞内钙离子浓度升高有关。极限强度的间歇运动状态下，机体随着运动血中氧分压下降而出现缺氧状态，脑缺氧后，突触前膜的去极化，引起谷氨酸（Glu）释放入突触间隙，并与突触后膜的NMDA受体结合，引起细胞膜上G蛋白构型改变，通过磷脂酶C（PLC）加强磷脂酰肌醇（PI）系统的降解，三磷酸肌醇（IP3）水平上升，作用于细胞内的钙库——内质网和线粒体，使胞内钙离子浓度升高，同时激活高传导性阳离子通道，引起胞外钙离子内流，激活鸟苷酸环化酶（GC）和蛋白激酶（PKC），然后通过一系列蛋白磷酸化诱导c-fos蛋白表达[11]。当然，也有研究认为，胞内钙离子浓度升高时，与钙调蛋白（CaM）结合形成Ca/CaM复合物，对转录因子进行磷酸化修饰，从而启动c-fos基因的表达[31]。
另外，在实验中我们还观察到，c-fos基因在BLA中的蛋白表达具有很强的时效性。在间歇训练结束后，大鼠BLA中c-fos蛋白表达随时间的增加快速升高，2 h时c-fos蛋白表达达到峰值，与对照组相比具有非常显著性差异（ P ＜0.01）；然后随时间的延长大鼠BLA中c-fos蛋白表达开始下降，到了4 h时，c-fos蛋白表达明显减少，但仍然高于对照组，具有显著性差异（ P ＜0.05）。分析原因：1) 在间歇训练的刺激下，大鼠BLA中c-fos主要为早期瞬间表达，在训练后几小时即快速表达，然后启动二级结构基因，而自身由于受到次级基因的反馈性抑制的影响，后期表达水平下降；2) c-fos及c-jun基因中存在AP-1结合位点可能起着某种反馈性自我调节作用；3) 间歇性训练不同于大强度衰竭性训练，尽管强度接近极限，但由于间歇期的存在，当一定程度的短暂缺血、缺氧刺激还不至于对大脑形成损伤时，缺血、缺氧所导致的代偿作用已经形成，而在每两次训练的有限间歇时间内 ，已形成的代偿作用尚继续保持甚至不断加强，直到下一次训练开始。因此，不会象大强度衰竭性训练那样使大鼠BLA中神经元内Ca2+浓度过度升高，导致钙超载[32]，引起c-fos基因的过度表达。
综上所述，间歇运动可引起大鼠杏仁基底外侧核c-fos表达发生改变，且具有一定的规律性。因此，我们可以根据c-fos在运动后，表达的主要脑区、不同时间表达强度及基因诱发蛋白表达情况，从时间上针对相关靶基因进行干预，这对于预防极限强度后的病理损伤具有重要意义。
参考文献：
［1］ S.M.Arkin, Elder rehab. A student surpervised exercise program for Alzheimer patients Gerontology，1999,39:729-735.
［2］ Jo Larsen, M Skalicky, A Viidik.Does long-term physical exercise counteract age-relate purkinje cell loss? A stereological study of rat cerebellum. Comp.Neurol，2000,428:213-22.
［3］ MP. Mattson.Neuroprotective signaling and the aging brain: take away my food and let me run.Brain res，2000,886:47-53.
［4］ Anderson BJ, Rapp DN, Baek DH, McCloskey DP,Coburn-Litvak PS, Robinson JK. Exercise influences spatial learning in the radial arm maze. Physiology and Behaviar，2000,70(5):425-9.
［5］ Laurin D, Verreault R, Lindsay J, MacPherson, Rockwood K. Physical activity and risk of cognitive impairment and dementia in elderly persons.Archives of Neurology，2001，58(3):498-504.
［6］ Raffaella Molteni, Zhe Ying and Fernando Gomez-Pinilla. Differential effects of acute and chronic exercise on plasticity-related genes in the rat hippocampus revealed by microarray. European Journal of Neuroscience，2002,16:1107-1116.
［7］ J.L.Trejo, E.Carro, I. TORRES-Aleman, Circulating insulin-likegrown factor I mediates exercise-induced increases in the number of new neurons in the adult hippocampus. J Neurosci，2001,22:1628-1634.
［8］ Morgan JI, Curran T, Stimulus transcription couping in the nervous system involvement of the inducible proto-oncogenes fos and jun［J］. Annu Rev Neurosci,1991,14：421.
［9］ Makoto, Funahashi, Yifen He, et al. Noxious tooth pulp stimulation suppresses c-fos expression in the rat hippocam2 pal formation［J］.Brain Research,1999,827：215.
［10］ Katano H, Fujita K, Kato T, et al. A metabotropic glutamate receptor antagonist, alpha-methyl-4-car- boxyphenylglycine, attenuates immediate early gene mRNA expression following traumatic injury in cultured rat cortical glial cells［J］.Neurosci Lett,2001,306(1-2)：101.
［11］ Kovacs KJ. c-fos as a transcription factor: a stressful (re)view from a functional map［J］.Neurochemistry International,1998,33(4) ：287-297.
［12］ Verma LM, Sessone P. Proto-oncogene fos complex but versatile regulation［J］.Cell,1987,51：513.
［13］ 任瑜，于布为.BLA号与情绪相关记忆的最新研究进展［J］.麻醉学新进展(2007)(精)，北京：人民卫生出版社，2001，4，1.
［14］ Honkamiemi T.Induction of multiple immediate early gene in rat hypothalamic prarventricular nucleus after stress［J］.Molecular Brain Research,1994,25：234.
［15］ Morgan JI,Curran T.Immediate-early genes: ten years on［J］.Trends Neurosci, 1995,18：66.
［16］ Akin PT, Liu PK,Hsu CY. Immediate early gene expression in response to cerebral ischema: friend or foe? ［J］ Stroke,1996, 27：1682.
［17］ 王伟，康静琼，阮旭中等. c-fos反义寡核苷酸对谷氨酸处理海马神经元的保护作用［J］.临床神经科学，2001,9(2)：109.
［18］ Dayas CV,Buller KM,Crane JW,Xu Y, Day TA.Stressor categorization: acute physical and psychological stressors elicit distinctive recruitment patterns in the amygdale and in medullary noradrenergic cell groups［J］. European Journal of Neuroscience，2001,14(7)：1143-1152.
［19］ Taeck-Hyun Lee, Mi-Hyeon Jang, Min-Chul Shin, et al.Dependence of rat hippocampal c-Fos expression on intensity and duration of exercise［J］.Life Sci, 2003,72(12)：1421-1436.
［20］ Myoung-Hwa L, Hong K,Baek-Vin L et al. Naloxone potentiates treadmill running induced increase in c-fos expression in rat hippocampus［J］. Life Science, 2003,73：3139-3147.
［21］ Eilam R, Davidson A,Gozes I, Segel M. Locomotor activity causes a rapid up-regulation of vasoactive intestinal peptide in the rat hippocampus［J］.Hippocampus,1999,9(5)：534-541.
［22］ Cullinan WE, Herman JP, Battaglia DF, Akil H, Watson SJ.Pattern and time course of immediate early gene expression in rat brain following actue stress［J］. Neuroscience,1995, 64(2)：477-505.
［23］ Oladehin A,Waters RS.Location and distribution of Fos protein expression in rat hippocampus following actue moderate aerobic exercise［J］. Experiment Brain Research, 2001,137(1)：26-35.
［24］ Morgan JI, Curran T. Proto-oncogene transcription factors and epilepsy［J］.Trends Pharmacol.Sci, 1991,12(9)：343.
［25］ Divish MM, Sheltel G, Boyle A, et al.Differential effect of lithium on c-fos protooncogene expression mediated by receptor and prostreceptor activators of protein kinase Cand cyclic adenosine monophosphate: model for its antimantic action［J］.J Neurosci Res,1991,28：40.
［26］ 徐波，季浏，林龙年，等.游泳训练对大鼠学习记忆和脑内神经递质的影响［J］.中国运动医学杂志,2004, 23(3)：261-265.
［27］ 姚泰.生理学［M］.北京：人民卫生出版社，2001：455～460.
［28］ McGaugh JL．Memory consolidation and the amygdala：a systems perspective［J］．Trends Neurosci，2002，25(9)：456.
［29］ Dayas CV,Buller KM,Crane JW,et al.Stressor categorization:acute physical and psychological stressors elicit distinctive recruitment patterns in the amygdala and in medullary noradrenergic cell groups.Eur J Neurosci 2001,14:1143-1152.
［30］ 洪长青，邓树勋.三种训练对大鼠心肌细胞超微结构的影响［J］.浙江体育科学，2000，22（3）：55-58.
［31］ Sharp FR，Gonzolez MF，Hisanaga K,et al. Induction of the c-fos gene product in rat forebrain following cortical lesions and NGF injection［J］.Neurosci Lett,1989,100：1171.
［32］ 胡旺平，李雪梅，化长林，等.力竭游泳对大鼠海马突触体内游离钙浓度的影响［J］.中国运动医学杂志,2002,21(6):617.
