一株羊源A型产气荚膜梭菌的分子生物学诊断

摘 要：为查明河南省邓州市某羊场病死羊病因，尽快控制病情，采集病羊肝脏、肺脏和脾脏等器官组织样本进行细菌16S rDNA PCR扩增测序，并利用MEGA7.0软件构建系统进化树，PCR鉴定毒素基因分型。结果表明，在病料中分离鉴定出一株分离菌；对该分离菌株进行16S rDNA基因扩增，得到1 400 bp阳性条带，与产气荚膜梭菌核苷酸同源性均在99.6%以上，进行核苷酸同源性比对，与产气荚膜梭菌参考菌株相似性在99.6%以上，表明为产气荚膜梭菌；PCR毒素基因分型得到324 bp阳性条带，符合α毒素基因特征，证实其为A型产气荚膜梭菌，命名为DENGZHOU202409；构建遗传进化树进行分析，发现DENGZHOU202409菌株与上海人源218002-301、印度豹源ATCC 13124处于同一小分支，亲缘关系较近。综上所述，DENGZHOU202409分离菌株为此次羊群感染致病的病原菌，为A型产气荚膜梭菌。

关键词：羊；产气荚膜梭菌；16S rDNA；毒素分型

中图分类号：S826；S855.3 文献标志码：B 文章编号：1674-7909（2025）1-104-4

DOI：10.19345/j.cnki.xckj.1674-7909.2025.01.018

0 引言

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一种革兰氏阳性、厌氧性芽孢杆菌，广泛分布于土壤、水体和腐烂植物残体等环境中，也存在于人类和动物的胃肠道中。作为机会性病原菌，该菌能够在免疫力下降的宿主肠道内迅速增殖并产生20多种毒素［1］，可导致宿主食物中毒、气性坏疽、肠毒血症及多器官组织损伤，出现不同病理特征［2］，会给畜牧业发展和人类健康带来严重危害。

2024年9月初，河南省邓州市某养羊场部分羊陆续出现食欲下降、便血、腹泻和腹部膨胀的症状；病羊发病突然，肌注氨苄西林注射液后未明显好转，陆续出现死亡（发病到死亡的时间为1～2 d）；共发病6只，死亡4只。为尽快查明病因，控制病情，采用细菌培养、16S rDNA核酸PCR扩增、测序比对和毒素基因分型等技术手段，从病死羊组织器官中分离鉴定出1个菌株。

1 材料与方法

1.1 病料采集和试验动物

无菌采集病死羊肺脏、脾脏、肝脏和肠道内容物等样本，将其分别装入不同采样袋，记录编号、样本名称和日期等必要信息，并立即送实验室进行病原学检测。

1.2 主要试剂和仪器

TSN琼脂、绵羊血平板，均购自杭州微生物试剂有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；16S rDNA Bacterial Identification PCR kit试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小提取试剂盒（Ver.4.0）、PGM-T产物克隆试剂盒（VT302-02）、大肠杆菌DH5α感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix及DL 1500 DNA Marker，购自天根生化科技（北京）有限公司；凝胶成像仪（TGel Plus）、梯度PCR仪（OSE-GP-03/05），购自天根生化科技（北京）有限公司；生物显微镜（CX23），购自上海倍莱德仪器有限公司；电泳仪（DYCZ-24FN），购自北京六一生物科技有限公司。

1.3 引物设计

参考王斌等［3］、刘增禄等［4］和司南等［5］学者研究方法，利用Primer Premier 5. 0软件设计7对产气荚膜梭菌毒素基因分型引物，委托华大基因有限公司合成。引物信息见表１。

1.4 细菌分离培养

将病料分别接种于绵羊血平板和TSN琼脂培养基，37 ℃厌氧培养24 h，挑取单个菌落制作涂片，进行革兰氏染色，并镜检。同时，挑取单个菌落多次在TSN琼脂培养基上划线接种增菌，观察细菌在培养基上的表型特征。

1.5 细菌16S rDNA PCR检测和遗传进化分析

利用细菌DNA提取试剂盒提取分离菌株DNA，以此为模板，采用16S rDNA Bacterial Identification PCR kit试剂盒提供的引物（F：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′，R：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′）进行PCR扩展菌种鉴定。反应体系：2×Taq PCR MasterMix 25μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板50～100 ng，补足16S-free H2O至总体积50 μL。反应程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30ｓ，55 ℃ 30ｓ，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存，PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照记录。将扩增得到的阳性DNA片段与pGM-T Easy载体进行16 ℃过夜连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；转化后，将细胞复苏并涂布于含有氨苄抗性的LB平板上；将涂布好的平板倒置放入37 ℃恒温培养箱过夜培养。观察平板上长出的菌落，选择边缘清晰、单独生长的白色菌落，用无菌牙签或接种环挑取单菌落，并转移到新的含有氨苄抗性的LB平板上进行放大培养。将培养过的菌液进行离心处理，弃上清液，留细菌沉淀；然后按照质粒小提试剂盒说明书操作提取质粒，将经PCR鉴定正确的阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。在NCBI数据库中选择参考菌株（见表2），采用 MEGA7. 0 软件构建系统进化树。

1.6 细菌毒素基因分型PCR检测

利用产气荚膜梭菌7对毒素基因分型引物，分别对分离菌株PCR检测携带毒素基因情况，以判定分离菌株毒素类型。PCR反应体系同1.5章节中表述，反应程序除退火温度（各引物退火温度见表1）外，其余程序不变。反应结束后，4 ℃保存，PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照记录。阳性产物胶回收、纯化，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，并将测序结果进行BLAST核苷酸同源性比对。

2 结果分析

2.1 细菌分离培养

细菌37 ℃厌氧培养24 h后，在TSN培养基上形成黑色菌落（如图1A）、在绵羊血培养基上形成双层溶血环（如图1B）。镜检可见，细菌外观为短粗杆状，单个或成对排列，革兰氏染色阳性（如图1C）。此次从肝脏、肠系膜、脾脏和肾脏病料中共分离4株表型一致的细菌，命名为DENGZHOU202409。

2.2 细菌16S rDNA基因PCR检测和遗传进化分析

DENGZHOU202409菌株16S rDNA基因PCR检测结果发现，在1 400 bp处产生一条明亮清晰条带（见图2），符合预期目的条带。序列BLAST比对结果显示，DENGZHOU202409菌株与产气荚膜梭菌核苷酸同源性均在99.6%以上，表明为产气荚膜梭菌。核苷酸同源性比对，DENGZHOU202409菌株与参考株相似性均为99.6%。通过构建遗传进化树（见图3）分析，发现DENGZHOU202409菌株与上海人源218002-301、印度豹源ATCC 13124处于同一小分支，亲缘关系较近，与西藏牦牛源BG01、华东兔源SD14-02、云南奶山羊源KM-1、韩国驴源KSJ-28和北京人源1005-15098亲缘关系较远。

2.3 细菌毒素基因分型

利用产气荚膜梭菌特异性毒素基因引物PCR扩增分离菌株，电泳检测发现该菌株产生大小为324 bp的条带（见图4），初步判断为编码α毒素基因（clostridium perfringens alpga，CPA），未检出其他6种毒素基因片段。测序BLAST比对可知，与CPA基因核苷酸同源性为99.9%，证实分离菌株为携带α毒素的A型产气荚膜梭菌。

3 讨论

感染A型产气荚膜梭菌的反刍动物死亡率为70%～100%［6］。A型产气荚膜梭菌会产生几种毒素，包括肠毒素和β2［7］。关于反刍动物A型肠道感染的发病机制，一般认为大多数临床症状和病变是由CPA的影响造成的［8］。CPA是气性坏疽的主要致病因，位于染色体上，高度保守，因此存在于所有产气荚膜梭菌菌株中。α毒素是一种磷脂酶C鞘磷脂酶（卵磷脂酶），它与细胞膜结合并导致脂质双层的破坏。这种毒素具有溶血和损害皮肤作用。α毒素水解卵磷脂产生二酰基甘油，从而刺激真核细胞磷脂酶和花生四烯酸级联反应［9-10］。这个过程可能会导致血管通透性、血小板聚集和血管收缩的改变。

4 结论

利用分子生物学方法对河南省邓州市某羊场病羊进行病原学检测，证实A型产气荚膜梭菌是病羊的致病因子，可为今后产气荚膜梭菌流行病学研究和防控提供临床资料参考。

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Molecular Biological Diagnosis of a Strain of Sheep-derived

Clostridium" Perfringens Type A

WANG Kui

Dengzhou Animal Disease Prevention and Control Center， Dengzhou 474150， China

Abstract： In order to determine the cause of dead sheep in a sheep farm in Dengzhou City and control the spread of the disease as soon as possible， the samples of liver， lung， spleen and other organs and tissues of the diseased sheep were collected for bacterial 16S rDNA PCR amplification and sequencing. The phylogenetic tree was constructed using MEGA7.0 software， and the toxin genotyping was identified by PCR. The results showed that a strain of isolated bacteria was isolated and identified in the diseased material. The 16S rDNA gene of the isolated strain was amplified to obtain a 1 400 bp positive band， and the nucleotide sequence homology with Clostridium perfringens was more than 99.6%. The nucleotide homology was compared with the reference strain of Clostridium perfringens， and the similarity was more than 99.6%， indicating that it was Clostridium perfringens. A 324 bp positive band was obtained by PCR toxin genotyping， which was consistent with the characteristics of alpha toxin gene. It was confirmed to be Clostridium perfringens type A and named DENGZHOU202409. By constructing a genetic phylogenetic tree analysis， DENGZHOU202409 strain was in the same small branch with Shanghai human source 218002-301 and Indian leopard source ATCC 13124， and the genetic relationship was close. In summary， the isolated strain of DENGZHOU202409 was the pathogenic bacteria of this sheep infection. This experiment provided a clinical reference data for the diagnosis and treatment of Clostridium perfringens.

Key words： sheep; Clostridium perfringens; 16S rDNA; toxin typing

（栏目编辑：姜春艳）

作者简介：王奎（1988—），男，硕士，助理兽医师，研究方向：动物疫病防控。