蜡样芽孢杆菌检测方法的研究进展

摘要：蜡样芽孢杆菌是革兰氏阳性杆菌，且能产芽孢，是一种食源性条件致病菌，误食蜡样芽孢杆菌超标的乳制品、糕点、腐乳、发酵食品等会引起食物中毒。准确、快速、高效地检测蜡样芽孢杆菌对预防蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒具有重要意义。本文以蜡样芽孢杆菌为研究对象，对其检测方法进行了概括总结，说明不同检测方法的优缺点，为快速检测鉴定该菌提供一定的参考。关键词：蜡样芽孢杆菌；食源性；条件致病菌

中图分类号：S852.6文献标志码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1674-4977.2025.01.057

基金项目：辽宁省联合基金项目面上资助计划项目（2023-MSLH-086）：基于MALDI-TOFMS技术建立豆制品中蜡样芽孢杆菌快速检测平台。

1蜡样芽孢杆菌的危害

蜡样芽孢杆菌在饲料、食品、土壤中广泛存在，是一种革兰氏阳性条件致病菌，其产生的内生孢子可抵抗外界不良环境，可抵抗高温、高压、酸、碱等不利因素[1]。蜡样芽孢杆菌根据致病性分为产毒株和不产毒株，产毒株产生的腹泻毒素和呕吐毒素对人们健康和食品安全造成巨大威胁。

2010—2019年全国细菌性食物中毒事件蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒事件占总数的11.89%（132/ 1110），仅次于非伤寒沙门氏菌和副溶血型弧菌，处于第3位[2]。2020—2022年泰州市500份预包装糕点中97份检出蜡样芽孢杆菌，检出率为19.4%[3]。携带毒力基因3种以上的菌株达100%，其中22株携带10种以上毒力基因，具有较大的安全隐患。产呕吐毒素的蜡样芽孢杆菌共检出5株，其中4株携带3种毒力基因，1株携带1种毒力基因，说明仅针对1种呕吐毒素毒力基因检测会产生呕吐型蜡样芽孢杆菌假阳性的现象。2022年山东济宁对辖区内90份样品进行蜡样芽孢杆菌监测，结果检出率为24.44%，其中外卖送餐蜡样芽孢杆菌检出率最高，达46.67%[4]。淮安市抽取218批婴幼儿食品定量检测蜡样芽孢杆菌，39批次检出蜡样芽孢杆菌，检出率为17.89%[5]。毒力基因检测结果显示分离的蜡样芽孢杆菌100%携带1种或1种以上毒力基因，但未检出ces呕吐毒素毒力基因。检测结果说明，婴幼儿食品受蜡样芽孢杆菌污染情况不容乐观，需引起相关部门重视。由此可见，准确、快速、高效地检测蜡样芽孢杆菌对预防蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒具有重要意义。本文以蜡样芽孢杆菌为研究对象，对其检测方法进行了概括总结，说明不同检测方法的优缺点，为快速检测鉴定该菌提供一定的参考，为食品安全监督管理提供支持。

2免疫磁珠法

平阳等[6]研发了一种快速分离熟制食品中蜡样芽孢杆菌的免疫磁珠法。采用兔抗蜡样芽孢杆菌抗体和免疫磁珠相结合，同时用蜡样芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、阪崎肠杆菌对炒青菜、鸡丝花菜、红烧肉、卤鸭肉等样品进行人工污染，分别取样品25 g加入225 mL稀释液中充分混匀，加入免疫磁珠在37℃充分振荡吸附15 min后检测，其灵敏度限值为4×10-7CFU/mL，在食品基质中捕获率可达62%，该方法可特异性检测蜡样芽孢杆菌，排除其他致病菌对蜡样芽孢杆菌检测的干扰。

3分子生物学法

3.1荧光定量PCR法

杨建等[7]建立了一个荧光定量PCR法，检测乳制品中蜡样芽孢杆菌，通过对蜡样芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌检测，特异性良好无交叉反应，蜡样芽孢杆菌最低检出限为1×10-7ng/μL，将蜡样芽孢杆菌添加至牛奶样品中，10.4 CFU/mL的蜡样芽孢杆菌即可检出。马琳琳等[8]提出一种以gyrB作为基因检测食品中蜡样芽孢杆菌的方法，该方法对蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌特异性良好，灵敏度可达0.01 mg/L，活菌检出限为8.9×10-2CFU/mL。杨滴等[9]根据蜡样芽孢杆菌肠毒素基因片段序列设计引物和探针，建立实时荧光PCR法检测蜡样芽孢杆菌。对蜡样芽孢杆菌标准菌株及含有苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌在内的20种菌株进行实验，结果显示特异性良好，无假阳性或假阴性现象，灵敏度高，检测低限可达1×103CFU/mL。

3.2多重PCR法

刘秀峰等[10]建立多重PCR方法对蜡样芽孢杆菌进行分型。根据蜡样芽孢杆菌的hbl A、hbl C、nhe A、nhe B、bce、cyt K和cer基因设计引物，对120株蜡样芽孢杆菌进行毒力基因检测，结果显示携带呕吐毒素毒力基因的蜡样芽孢杆菌占96.66%（116/120）。姜菲菲等[11]以nhe、cyt K和ent FM这3种毒素基因作为标志物，建立一种多重PCR快速检测蜡样芽孢杆菌。该方法可快速检测蜡样芽孢杆菌，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌具有特异性，且3种引物在同一反应体系中无干扰，最低检出限可达0.1 mg/L，具有高灵敏度。

3.3环介导等温扩增法

周巍等[12]根据蜡样芽孢杆菌hbl A基因的特异性建立一种环介导恒温扩增技术检测发酵乳中的蜡样芽孢杆菌。将人工污染蜡样芽孢杆菌的发酵乳接种至营养肉汤中，在36℃±1℃条件下培养20 h后提取蜡样芽孢杆菌的DNA，采用建立的LAMP法进行检测，同时以巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、福氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌的基因组DNA为模板进行扩增，均无扩增产物，说明该方法可特异性检测蜡样芽孢杆菌。该方法以发酵乳为基质菌量在2.1×102 CFU/mL时即可被检出。唐璎等[13]采用双层膜富集法提取样品中的目标菌，磁珠法对目标菌DNA进行纯化提取，将微流控芯片与LAMP反应相结合快速检测蜡样芽孢杆菌，该方法检测限为10 CFU/mL。采用此法对苏云金芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157∶H7、蕈状芽孢杆菌等进行检测结果均为阴性，说明其具有较强的特异性。

3.4基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MAL？ DI-TOF MS）

Minling Chen等[14]用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪（Microflex LT/SH smart MALDI-TOF MS）对蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌进行鉴定，筛选出4组特异峰，蜡样芽孢杆菌的物种特异性峰为3211、6427、9188和9214 m/z，苏云金芽孢杆菌的物种特异性峰为3218、6441、9160和9229 m/z。上述特异峰均代表核糖体蛋白，这些蛋白是保守的，与蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的系统发育关系一致。Krzysztof F等[15]使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析了152个菌株（其中包括57个炭疽芽孢杆菌、49个蜡样芽孢杆菌、27个苏云金芽孢杆菌、18个魏德曼芽孢杆菌和1个魏氏芽孢杆菌等）检测特定生物标志物。使用主成分分析（PCA）对每个芽孢杆菌属物种质谱图进行分组，以确定蛋白质质谱图的一般差异，PCA分析揭示了7个不同的集群。发现炭疽芽孢杆菌特异性离子峰为3339、3592、4871、9740 m/z；苏云金芽孢杆菌特异性离子峰为2956、2968、3411 m/z，魏氏芽孢杆菌特异性离子峰为4637、7324、9272 m/z。

4讨论

国标方法检测蜡样芽孢杆菌检验周期较长，检验过程耗时费力，对人员要求高。免疫磁珠吸附法具有特异性强，灵敏度高的特点，可缩短检测周期，所用仪器设备均为实验室常用设备，但尚不能实现对目标菌的实时检测。荧光定量PCR实验室已普遍配置，检测周期短，但蜡样芽孢杆菌分为产毒株和不产毒株，产毒株又分为产腹泻毒素和产呕吐毒素，所以蜡样芽孢杆菌拥有多个毒力基因，若仅检测其中某个毒力基因则有漏检和假阴性的情况出现。多重PCR可对多个目标基因同时进行检测，但引物设计难度大，既要防止交叉反应，又要优化实验条件，否则易造成假阳性。LAMP法适于快速检测，设计引物时要强调特异性，关注其有无特异性扩增，操作时应注意气溶胶的产生，避免由气溶胶引起的结果异常。近年来基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MAL？ DI-TOF MS）作为一种新兴的以蛋白质指纹图谱为考察对象的鉴定方式，具有通量高，周期短等特点，前期仪器设备投入较大，限制其发展，但后续使用成本低于以上各种方法。每种检测方法优缺点不一，应从实际出发，发挥各种检测方法的长处，以便充分利用它们的优势。

参考文献

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作者简介

种婷，女，1982年出生，高级工程师，硕士，研究方向为食品中致病微生物检验。

（编辑：于淼，收稿日期：2024-03-23）