中国不同城市家用洗碗机中微生物多样性分析

关键词：洗碗机，微生物，高通量测序技术，多样性

DOI编码：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.013.043

0引言

随着经济发展，人民生活水平的提高，国内洗碗机市场需求明显增长。洗碗机作为方便居民生活的新兴家用电器，具有清洁高效、节能、省时等优点，可满足消费者对健康生活及享受闲暇时的需求，更加适应现代家庭快节奏的生活，已成为现代化家庭厨房设计的标配。但在洗碗机长期使用过程中，其潮湿的内环境和密闭的空间，容易发生餐具和内部件的微生物滋生现象。

目前，国际上已陆续开展了家用洗碗机内部环境微生物群落结构、特征微生物菌株分离及作用机制研究。Nina等[1]于2011年在欧洲、美洲、非洲等地共采集获得189个洗碗机样本，通过平板培养法从62%的样本中分离获得了曲霉属（Aspergillus）、假丝酵母属（Ca nd ida）、Ma g nusiomyce s 、镰刀菌属（F u s a r i u m）等微生物，研究发现皮炎外瓶霉（Exophia la der matitidis）和类砖型外瓶霉（Exophiala phaeomuriformis）是洗碗机中的优势菌种；于2015年在土耳其收集了937件洗碗机样品，并从24.5%的样品中检出外屏霉属（Exophiala）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、Magnusiomyces等微生物[2]；于2019年在斯洛文尼亚采集30台洗碗机样品，分离获得632株细菌，从80%的样品中均分离获得蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus），对洗碗机橡胶密封条进行细菌多样性分析，发现放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）为主要优势微生物[3]。Brands等[4]人研究发现洗碗机的内壁表面含菌量少，存储过程中肠杆菌科微生物有明显增加。综上所述，已有大量国际研究证明了家用洗碗机中存在部分潜在风险微生物，因此开展洗碗机内环境微生物多样性及菌种特性研究对于相关风险规避和产品质量升级具有重要意义。

我国目前已经发布了多个洗碗机相关的安全性能、除菌、抗菌等评价标准[5-8]，但关于洗碗机使用过程微生物多样性分析尚缺乏数据支持。本研究旨在研究我国洗碗机微生物群落结构，通过高通量测序技术和微生物培养技术，系统解析冬季中国不同城市家用洗碗机中微生物多样性，深度挖掘洗碗机中极端耐受类、致污类、致病类等特征性微生物资源，为洗碗机抗菌抑菌试验的开展、关键特征微生物作用机制的研究以及抗菌材料的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品信息

2021年12月至2022年1月，依据地理位置以及不同地域饮食习惯差异，选取北京、青岛、佛山3个城市共9台洗碗机（每台洗碗机的使用频率≥3次/周）作为研究对象，每台洗碗机设置3个采样位点（包括门封圈、出水口和提杯），共入户采集到27个样品，详细信息见表1。

1.2 试剂与仪器

麦芽提取粉琼脂（MEA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、R2A琼脂培养基、强化梭菌培养基（RCM）（北京陆桥技术股份有限公司），氯硝胺甘油琼脂培养基（DG18）（青岛海博生物技术有限公司），0.85%生理盐水（北京陆桥技术股份有限公司），丙三醇（国药集团化学试剂有限公司），QIAamp Fast DNAStool Mini Kit（德国QIAGEN公司），真菌DNA提取试剂盒（美国Omega Bio-Tek公司），磁磁珠组织DNA提取试剂盒（美国Omega Bio-Tek公司），PCRMasterMix、DL 2000 Marker（北京全式金生物技术有限公司），PCR引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

生物安全柜（ESCO AC2-6S1 CLASS II TYPEA 2），隔水式培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），微量可调移液器（德国Eppendor f公司），洗碗机（美的集团股份有限公司），电子天平（常熟市佳衡天平仪器有限公司），高速冷冻离心机（德国 Eppendorf 公司），生物样品均质器（奥然科技（北京）有限公司），PCR仪（ABI），微量核酸蛋白分析仪（英国Biochrom有限公司），凝胶成像仪（BIO-RAD Gel DoCqM EZ），高压灭菌锅（日本HIR AYAMA），电泳仪（美国BIO-R AD EC250 -90）。

1.3 可培养分析方法

1.3.1 可培养微生物的分离纯化

将洗碗机样品原液以10倍梯度逐级稀释，制得1：10的样品菌悬液。分别吸取样品原液和稀释后的菌悬液100 μL涂布于固体培养基上，每组两个平行，放置于培养箱中培养7～10天，培养基及培养条件详见表2。每天观察不同条件下的菌落特征（包括大小、形状、颜色、质地、有无渗透液、有无可溶性色素等），选取不同形态的单菌落进行平板划线，纯化得到菌株保存于甘油管。记录不同菌株的菌落特征和数量。

1.3.2 可培养微生物的菌种鉴定

选取的单菌落通过平板划线法进行纯化，在适宜的培养条件下通过两次分离纯化获得纯菌种，并通过MALDI-TOF MS进行初步鉴定，通过甲酸萃取法制备检测样品，挑取培养基上的单菌落，混匀于300 μL ddH2O中，加900 μL无水乙醇充分振荡，离心去除上清液，晾干后，用50 μL 70%甲醇重悬细胞，加50 μL乙腈反复吹打，将样品混合均匀；按照MALDI-TOF MS 检测规程进行鉴定分析，确定菌株的分类学地位。

对于MALDI-TOF MS无鉴定结果的菌株，提取细菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用细菌16 S rR NA基因通用引物27 F和149 2R 进行PCR 扩增，反应条件参数如下：94℃，5 min，1cycle；94℃、1 min，55℃、1 min，72℃、1.5 min，30cycles；72℃，10 min，1 cycle。将PCR产物在上海生工生物进行16S rRNA基因测序。将16S rRNA测序结果通过EzBio Cloud服务器（www.ezbiocloud.net/identify）进行相似性搜索，与已发表的有效模式菌株进行比较，确定菌株的分类学地位。对于真菌菌株，提取真菌菌株的基因组DNA，分别采用（I T SrDNA）、核糖体rDNA大亚基（26S D1 / D2）等分子标记引物对丝状真菌和酵母菌的核酸序列进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共27个循环；72℃ 10 min。得到的PCR产物送至生工生物进行测序。根据测序结果，用菌株的26S rDNA和ITS基因作为靶序列，在GenBank数据库中用BLAST程序搜索同源序列，挑选与靶序列最相近的参考菌株系列进行比较，获得菌株的分类学地位。

1.4 样品宏基因组提取和高通量测序

利用Q I A a m p D N A提取试剂盒，提取洗碗机样品种的宏基因组D N A。以质检合格的宏基因组D N A为模板进行P C R扩增，利用通用引物33 8F（5'-AC T C C TACG G GAG G C AG C A-3'）和8 0 6R（5'-G GACTACH VG G GTWTCTA A T-3'）扩增16 S r R NA 基因V3 -V4区；利用引物I T S1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGT TCT TCATCGATGC-3'）扩增ITSrDNA区。PCR扩增体系：5×FastPfu 缓冲液8 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L，上、下游引物各2 μL，FastPfu 酶1 μL，DNA 30 ng，ddH2O补足至40 μL。PCR 反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共27个循环；72℃ 10 min。使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化并溶于洗脱缓冲液中，完成文库的构建。使用Agilent 2100 Bioanalyzer对构建文库的片段范围及浓度进行检测，检测合格的文库利用HiSeq 2500平台进行扩增子测序。

1.5 数据分析

数据分析主要包括测序数据过滤、Tag拼接、OTU聚类、物种注释和物种复杂度分析等流程。利用QIIME 2的DADA2方法对下机数据进行质控，去除低质量序列、嵌合体并得到Clean Data。使用软件FLASH（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11），利用重叠关系将双末端测序得到的成对Reads组装成一条序列，得到高变区的Tags。利用软件USEARCH（v7.0.1090）将拼接好的Tags聚类为OTU，并采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列进行分类学分析，并在界、门、纲、目、科、属和种水平统计分析各样本的群落组成。利用QIIME2中q2-diversity方法进行Alpha多样性分析，chao指数、shannon指数共同表征样品的Alpha多样性。

2 结果与分析

2.1 洗碗机样品中可培养微生物的分离与鉴定

为探究洗碗机使用过程中微生物多样性，在属水平上统计洗碗机分离株种类和数量。本研究从冬季9 台洗碗机的2 7个样品中共分离获得2 45株微生物菌种，其中细菌148株，涵盖28个属，如图1（a）所示；真菌共分离获得9 7株，涵盖28个属，如图1（b）所示。其中，在属水平上分离频次较高的细菌主要芽孢杆菌属（Bacillus）、埃希氏杆菌属（Escherichia）、Cytobacillus 、微小杆菌（Exiguobacterium）、普里斯特氏菌属（Priestia）等；分离频次较高的真菌主要有分离频次较高的真菌主要有曲霉属（A spergi l lu s）、青霉属（Penicillium）、假丝酵母属（Candida）、镰刀菌属（Fusarium）、外瓶霉属（Exophiala）等。

通过韦恩图分析，3个城市的共有细菌为5种，如图2（a）所示。分别为芽孢杆菌属（Bacillus）、不动杆菌属（A c i n e t o b a c t e r ）、气单胞菌属（Aeromonas）、普里斯特氏菌属（Priestia）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）。芽孢杆菌属（Bacillus）在洗碗机门封圈、下水口等区域容易富集。不动杆菌属（Acinetobacter）在潮湿的环境中利于其生长。在3个城市中共有真菌为4种，如图2（b）所示。分别为曲霉属（Aspergillus）、假丝酵母属（Candida）、外瓶霉属（Exophiala）和镰刀菌属（Fusarium）。在洗碗机样品中存在大量曲霉，该属菌株在高湿条件下生长良好。假丝酵母属（Candida）在室温及37℃环境中均能生长。

2.2 洗碗机样品中微生物群落结构分析

本研究共完成了洗碗机27个样品的16S rRNA基因V 3 -V4区扩增子测序，共测序获得16 5 5个OTU。门水平上，变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）是洗碗机样品中的优势细菌菌门，相对丰度分别为68.38%和9.75%，如图3（a）所示。为了进一步明确细菌群落的物种组成，从属水平上对洗碗机样品细菌组成进行分析，如图3（b）所示，假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）和埃希氏杆菌属（Escherichia）是洗碗机样品优势细菌菌属，相对丰度占比均在5%以上，分别为14.59%、10.96%、6.11%。这几类属在菌种可培养分离中均有分离到，埃希氏杆菌属（Escherichia）的菌株分离频次较高。

对洗碗机27个样品进行I T S rDNA序列高通量测序，共测序获得691个OT U。其中，子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）是洗碗机样品中的优势菌，相对丰度分别为6 5 .14%和2 6 . 2 0 %，如图4（a）所示，为了进一步明确真菌群落的物种组成，从属水平上对洗碗机样品真菌组成进行分析，如图4（b）所示，假丝酵母属（Candida）是洗碗机样品优势真菌菌属，相对丰度占比达到10.14%，枝孢菌属（Cladosporium）、曲霉属（Aspergillus）和外瓶霉属（Exophiala）相对丰度占比均在5%以上，分别为8.11%、8.08%、6.05%。其中，假丝酵母属（Candida）、枝孢菌属（Cladosporium）、曲霉属（Aspergillus）和外瓶霉属（Exophiala）均是子囊菌门（Ascomycota）中的种类，在洗碗机可培养分离过程中均有分离，也是非培养中丰度较高的菌属；担子菌门（Bsidiomycota）的丝孢酵母属（Trichosporon ）和红酵母属（Rhodotorula）在大部分洗碗机样品中占有相对较高的丰度，在可培养实验中均有分离。

2.3 洗碗机样品中微生物多样性分析

根据地理位置和不同的饮食习惯，本研究选取了北京、青岛和佛山3个具有典型饮食习惯的城市，以shannon指数和chao指数作为代表，探究不同地域对微生物α多样性指数的影响，详见图5。在3个城市中，青岛地区微生物物种总数最高，见图5（a）和5（c），细菌chao指数在52～ 4 0 9之间，真菌chao指数在82～127.6之间，北京地区和佛山地区的微生物物种总数较低，细菌c h a o 指数在4 4.75～ 667.21之间，真菌chao指数在29～111.6之间，佛山地区的不同样品间细菌物种总数差异较大；shannon指数主要反应群落的异质性，青岛地区的不同样品间细菌多样性差异较大，青岛地区的洗碗机真菌多样性最高，北京地区的不同样品间真菌多样性差异较大，见图5（b）和5（d）。青岛地区的微生物在物种总数和多样性上均比其它两个城市的高，不同样品间的物种总数和多样性差异较大可能与该地区所选取三台洗碗机的微生物污染状况差异较大有关。

基于OTU的PCA主成分分析，如图6（a）所示，北京和青岛细菌群落结构具有较高的相似性，佛山其他两个城市具有较大的差异性；如图6（b）所示，佛山和青岛真菌群落结构具有较高的相似性，北京其他两个城市具有较大的差异性。不同地域对洗碗机中共有微生物的影响研究发现，北京、青岛和佛山3个城市注释到的细菌OTU数目分别为750、957和987，共有OTU数目为328个，如图7（a）所示，不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）和埃希氏杆菌属（Escherichia）是丰度排名前3位的共有细菌菌属，其中不动杆菌属（Acinetobacter）与可培养分离共有细菌菌属一致；北京、青岛和佛山3个城市注释到的真菌OTU数目分别为249、416和329，共有真菌OTU数目为87个，如图7（b）所示，其中假丝酵母属（Candida）、外瓶霉属（Exophiala）和曲霉属（Aspergillus）是丰度排名前3位的共有真菌菌属，与可培养分离共有真菌菌属基本一致。

2.4 洗碗机样品中微生物群落结构影响因素分析

为了进一步探究不同地域、不同采样位置、使用年限和是否有水处理系统对样品微生物群落结构的影响，选取chao和shannon指数，采用单因素方差分析，探究影响洗碗机微生物群落结构的关键因素，详见表3。单因素方差分析发现，不同采样位置对洗碗机样品细菌物种总数和多样性具有显著影响，不同地域对洗碗机样品真菌物种总数和多样性具有显著影响，使用年限和是否有水处理系统对样品微生物总数和多样性均无显著影响。

3 讨论

根据可培养方法和高通量测序结果可知，细菌主要有芽孢杆菌属（Bacillus）、埃希氏杆菌属（Escherichia）、普里斯特氏菌属（Priestia）、不动杆菌属（Aci netob a cter）等；真菌主要有曲霉属（A sp er g i l lu s）、假丝酵母属（Ca nd id a）、外瓶霉属（Exophiala）、青霉属（Penicillium）、Magnusiomyces、迈耶氏酵母属（Meyerozyma）等。

芽孢杆菌属（Bacillus）是自然界分布极为广泛的一类微生物，在厨房环境中普遍存在，尤其在洗碗机门封圈、下水口等区域容易富集，在不同城市大部分样品中均分离培养出芽孢杆菌属的微生物。据文献报道，大多数芽孢杆菌属细菌是无害的，但有一些对人和动物是有致病性的，该属的蜡样芽孢杆菌可引起食物中毒，已知蜡样芽孢杆菌在免疫受损患者中引起菌血症以及其他症状如呕吐和腹泻[9]，一些菌株产生不耐热肠毒素，在食入后10～15 h内引起腹泻。不动杆菌属（Acinetobacter）广泛分布于水、空气、食品之中，具有较强粘附力，能够形成生物膜，潮湿的环境利于其生长[10]，容易在洗碗机门封圈与出水口处富集。埃希氏杆菌属（Escherichia）为人和动物肠道中的一种细菌，大多数菌株是无害的，但某些血清型（EPEC、ETEC等）会在其宿主中引起感染[11]，能够引起人体或动物胃肠道感染，除胃肠道感染以外，还会引起尿道感染、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等[12]。曲霉菌属（Aspergillus）是自然界分布极广一类微生物，在洗碗机零部件中也存在大量曲霉，据文献报道，该属菌是空调系统积尘主要伴生真菌之一[13]，能够引起过敏反应并会导致霉变，在高湿条件下生长良好。假丝酵母属（Candida）对热的抵抗力不强，加热至60℃ 1小时后即可死亡，但对干燥、日光、紫外线及化学制剂等抵抗力较强，在室温及37℃环境中均能生长[14]。

洗碗机样品中分离到的大部分优势真菌广泛分布于自然环境中，如曲霉属、青霉属、枝孢菌属等；部分洗碗机样品中存在条件致病菌，如曲霉属、青霉属、假丝酵母属等；部分洗碗机样品中存在抗逆特性菌，如外瓶霉、假丝酵母、Magnusiomyces 等；外瓶霉、Magnusiomyces 是文献报道洗碗机中常见的真菌菌属[15 ]，在本研究洗碗机样品中均有分离到；外瓶霉属（Exophiala）的菌株分布广泛，通常从土壤、木材以及一些植物材料上分离得到，且耐高温（4 ～ 47℃），该属菌株是文献报道洗碗机中出现频率最高的黑酵母菌种，洗碗机橡胶类零部件是该类菌种的主要聚集地，研究推测橡胶类部件表面粗糙、具有疏水性、释放芳香烃类化合物是该类菌种聚集的主要原因[16 -17]。Magnusiomyces 分离自洗碗机、乳制品、医疗器械、土壤、水、空气、植物等环境，耐高温（5～47℃），生长pH范围（2.5～12），耐高盐（17% NaCl），可引起肺部感染，口腔感染，血液肿瘤病人败血症[18-19]。青霉属（Penicillium）广泛存在于空气、土壤及腐烂的水果、蔬菜、肉类中，洗碗机内部高湿的环境有利于青霉菌的生长，该属的种类很多，在蔬菜、粮食、肉类和食物上常有分布，多呈灰绿色，部分该属菌株有致病性，引起角膜、皮肤、外耳、呼吸道、泌尿系统感染和心内膜炎，可在严重免疫功能低下患者中引起播散性疾病，许多菌株产生真菌毒素[20]。迈耶氏酵母属（Meyerozyma）的菌株可用于发酵食品酿造，具有耐盐特性[21]。

4 结论

（1）本研究基于可培养技术共分离获得2 45株微生物菌种，其中细菌148株，涵盖28个属；真菌共分离获得97株，涵盖28个属。其中，在属水平上细菌优势菌属主要有芽孢杆菌属（Bacillus）、埃希氏杆菌属（Escher ich ia）、纤维芽孢杆菌属（Cytobacillus）、微小杆菌（Exiguobacterium）、普里斯特氏菌属（Priestia）等；真菌优势菌属主要有曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、假丝酵母属（Candida）、镰刀菌属（Fusarium）、外瓶霉属（Exophiala）等。通过高通量测序分析，门水平上，变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）是洗碗机样品中的优势细菌菌门；子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Bsidiomycota）是洗碗机样品中的优势真菌菌门。从属水平上，假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）和埃希氏杆菌属（Escher ichia）是洗碗机样品优势细菌菌属；假丝酵母属（Ca ndida）、枝孢菌属（Cladosporium）、曲霉属（Aspergillus）和外瓶霉属（Exophiala）是非培养中丰度较高的菌属。

（2）对洗碗机样品中的微生物多样性分析，在3个城市中，青岛地区细菌物种总数最高，北京地区和佛山地区的细菌物种总数较低，佛山地区的不同样品间细菌物种总数差异较大，青岛地区的不同样品间细菌多样性差异较大；青岛地区真菌物种总数和多样性最高，北京地区和佛山地区的真菌物种总数较低，北京地区的不同样品间真菌多样性差异较大。

（3）对洗碗机样品中微生物群落结构影响因素分析，不同采样位置对洗碗机样品细菌物种总数和多样性的具有显著影响，不同地域对洗碗机样品真菌物种总数和多样性具有显著影响，使用年限和是否有水处理系统对样品微生物总数和多样性均无显著影响。

（4）对洗碗机优势菌属特性分析，芽孢杆菌属（Bacillus）在厨房环境中普遍存在，在洗碗机门封圈、下水口等区域容易富集，曲霉菌属（Aspergillus）高湿条件下生长良好，假丝酵母属（Candida）对干燥、日光、紫外线及化学制剂等抵抗力较强，外瓶霉属（Exophiala）主要在洗碗机橡胶类零部件区域聚集，耐高温，是文献报道洗碗机中出现频率最高的黑酵母菌种。

作者简介

许华，硕士研究生，工程师，研究方向为洗碗机消杀技术。

姚粟，通信作者，博士，教授级高级工程师，研究方向为工业微生物。

（责任编辑：张佩玉）