酶底物法测定湖泊水中粪大肠菌群的不确定度评定

摘 要：根据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012），对湖泊水中粪大肠菌群的测量不确定度进行评估。按照《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》（HJ 1001—2018）要求，对湖泊水样进行连续10次重复测定，分别评估MPN的不确定度和样品体积的不确定度。测得水样粪大肠菌群浓度为5.2×102MPN/L，拓展不确定度为0.15lg（MPN/L）。结果表明，MPN是影响粪大肠菌群浓度不确定度的主要分量，对MPN的不确定度评定需要同时考虑MPN值的不确定度和重复测量的不确定度。

关键词：不确定度；酶底物法；MPN；粪大肠菌群

中图分类号：X52 文献标志码：B 文章编号：1674-7909（2024）10-154-4

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.10.035

0 引言

粪大肠菌群主要来源于人和动物的粪便，因其能反映水体受粪便污染的程度而被作为环境指示菌［1］。酶底物法根据酶原反应检测粪大肠菌群，用最大可能数法（MPN法）计算结果，检出限低，准确度高，操作简便［2］。目前，尚未有文献系统评定酶底物法检测粪大肠菌群的测量不确定度。

测量不确定度不仅是判定基准标准精度、检测水平高低及测量质量的一个重要依据，也是评估实验室质量管理的重要内容。实验室资质认定和实验室认可评审，均对实验室测量不确定度评估作出了明确规定［3-4］。

以湖泊表层水为试验材料，按照《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》（HJ 1001—2018）、《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012），用科立得试剂盒分析粪大肠菌群测定过程中主要的不确定度分量来源，通过计算合成不确定度和拓展不确定度，建立用酶底物法检测粪大肠菌群的结果不确定度评定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：酶底物法试剂（科立得）、无菌取样瓶（含硫代硫酸钠）120 mL、97孔定量盘、科立得97孔阳性比色盘、江西省南昌市进贤县军山湖表层湖水。

仪器：SN310C立式蒸汽灭菌器、9900Z Sealer plus智能程控定量封口机、BSP-150生化培养箱、YP2102电子天平。

1.2 试验方法

1.2.1 接种

根据《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》（HJ 1001—2018），由一名操作人员在同一试验环境下对水样重复测定10次。

1.2.2 培养

将封口的97孔定量盘放入恒温培养箱中，在37 ℃±1 ℃条件下培养24 h。

1.2.3 结果判读

将培养后的97孔定量盘与标准阳性比色盘比较，样品孔变为黄色判断为粪大肠菌群阳性；记录97孔定量盘中大孔和小孔的阳性孔数量，据此查阅MPN表，得到相应MPN值；结合样品取样体积，计算样品中粪大肠菌群的含量。

2 不确定度分析

2.1 数学模型建立

根据《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》（HJ 1001—2018），样品中粪大肠菌群浓度C（MPN/L）计算公式见式（1）。

[C=MPN×1 000v]" " " " " " " " " " " " " " （1）

式中：MPN为每100 mL样品中总大肠菌群、粪大肠菌群或大肠埃希氏菌群数；[v]为接种量，mL。

在使用科立得试剂盒进行粪大肠菌检测时发现，无论采取何种方式倾倒样品与培养基的混合液，定量瓶中始终存在一定量的液体残留。因此，在粪大肠菌群浓度的计算公式中应除以实际加入97孔定量盘的样品体积[v1]。粪大肠菌群浓度计算公式见式（2）。

[C=MPN×1 000v1]" " " " " " " " " " " " " "（2）

模型采取重量法间接测量97孔定量盘中的水样体积，即假定水样与培养基在定量瓶中经充分混匀后才会进行液体转移，此时溶液中液体（水样）与可溶性固体（培养基）比例始终等于加入样品瓶中水样质量[m1]与培养基质量[m2]之比。因此，加入97孔定量盘的水样质量[m4]可通过这一比例与混合液质量[m3]相乘得到，再除以水样密度即为水样体积[v1]，计算公式见式（3）（[ρ]为水样密度，取1.000 g/mL）。

[v1=m1×m3（m1+m2）×ρ]" " " " " " " " " " " " "（3）

2.2 不确定度来源分析

根据数学模型、不确定度分量评定的可行性、文献报道，确定样品体积、MPN为合成标准不确定度的不确定度分量。

3 不确定度评定

3.1 样品体积引入的标准不确定度[uc（v1）]

天平的拓展不确定度[U]=0.02 g，k=2，则天平的标准不确定度[uB（m）]为0.01 g。

水样质量、试剂质量、样品培养基混合液质量均由减重法获得，具体数据见表1。

水样质量的标准不确定度[um1]计算公式见式（4）。

[um1=u2m1+2u2Bm=0.129 8 g]" " " "（4）

试剂质量的标准不确定度[um2]计算公式见式（5）。

[um2=u2m2+2u2Bm=0.019 0 g]" " " "（5）

样品培养基混合液质量的标准不确定度[um3]计算公式见式（6）。

[um3=u2m3+2u2Bm=0.120 6 g]" " " "（6）

由于[m1]、[m2]、[m3]均由同一台天平测得，在计算[v1]的合成标准不确定度时需要考虑[m1]、[m2]、[m3]间的相关性。加入97孔定量盘样品体积的合成不确定度平方[u2cv1]、相对不确定度[ucrelv1]计算公式分别见式（7）、式（8）。

[u2cv1=∂v1∂m12u2m1+∂v1∂m22u2m2+∂v1∂m32u2m3+2∂v1∂m1∂v1∂m2×um1，m2+2∂v1∂m1∂v1∂m3×um1，m3+2∂v1∂m2∂v1∂m3×um2，m3=0.023 7 mL2]" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " （7）

[ucrelv1=uv1v1=0.001 6]" " " " " " " " "（8）

3.2 MPN的标准不确定度[ucMPN]

军山湖水样10次粪大肠菌群浓度测定结果的MPN值及其标准不确定度见表2。

MPN值的标准不确定度包括MPN值自身的标准不确定度[uMPN1]和重复测量的标准不确定度[uMPN]。

MPN值的标准不确定度[uMPN1]计算公式见式（9）。

[uMPN1=i=1N=101N2u2MPNi=0.025 5]

[lg（MPN/100 mL）]" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（9）

MPN值重复测量的标准不确定度[uMPN]计算公式见式（10）。

[uMPN=sMPNn=0.041 5lg（MPN/100 mL）]" " " nbsp; " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（10）

MPN的合成标准不确定度[ucMPN]计算公式见式（11）。

[ucMPN=u2MPN1+u2MPN=0.048 7]

[lg（MPN/100 mL）]" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（11）

MPN值的相对不确定度[ucrelMPN]计算公式见式（12）。

[ucrelMPN=ucMPNMPN=0.028 4]" " " " " " " " （12）

3.3 粪大肠菌群浓度的合成不确定度[ucC]

粪大肠菌群浓度的合成不确定度[ucC]计算公式见式（13）。

[ucC=ucrelC×C=u2crelMPN+u2crelv1×C=0.077lg（MPN/L）]" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " （13）

3.4 扩展不确定度计算

在95%置信水平下，取k=2，计算扩展不确定度，即[U=2ucC=0.15lg（MPN/L）]。

3.5 结果报告

样品中粪大肠菌群浓度检测结果为5.2×102 MPN/L，换算成常用对数为2.72lg（MPN/L），最终拓展不确定度为（2.72±0.15）lg（MPN/L）（包含因子k=2，置信水平95%）。

4 讨论

研究建立了符合《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》（HJ 1001—2018）的数学模型，可依据此模型进行检测结果的测量不确定度评价。模型中不确定度分量为样品体积和MPN。由于样品量取使用的无菌定量瓶缺少可供参考的不确定度参数，研究采取重复测量加入97孔定量盘水样重量的方法，间接测量水样体积的A类不确定度。不同于以往研究［5-6］，该模型认为MPN的不确定度包括MPN值的不确定度和重复测量的不确定度。MPN值的不确定度可根据MPN值给出的95%置信区间，以B类不确定度评定方法计算。

从计算过程可以发现，MPN的相对不确定度远大于样品体积的相对不确定度，即酶底物法检测粪大肠菌群浓度的不确定度是由MPN的不确定度决定的。这与微生物检测的随机性及MPN表是基于先验统计分布给出检测量的可能范围而非一个确定的值有关。

MPN不确定度的计算应根据样品测量次数确定。单次测量时，MPN不确定度即MPN值的不确定度；当测量次数不小于2次时，MPN不确定度包括MPN值的不确定度和重复测量的不确定度。当测量次数为2～9次时，使用极差法计算重复测量的不确定度；当测量次数不少于10次时，使用贝塞尔公式计算重复测量的不确定度。

参考文献：

［1］张少峰，刘国强，魏春雷.粪大肠菌群检测方法及研究进展［J］.海洋通报，2008（3）：102-106.

［2］杨琳.Colilert（科立得）固定底物技术酶底物法的快速检测方法分析［J］.大众科技，2012，14（4）：131-132.

［3］国家标准化管理委员会.检测和校准实验室能力的通用要求：GB/T 27025—2019［S］.北京：中国标准出版社，2019.

［4］中国合格评定国家认可委员会.测量不确定度评估和报告通用要求：CNAS-CL07：2006［S/OL］.北京：中国合格评定国家认可委员会，2011：2-1［2011-11-01］.https：//www.cnas.org.cn/extra/col23/1320048632.pdf.

［5］胡巅，李素芳，丁武.MPN法检测结果的不确定度及其评定［J］.现代预防医学，2013，40（10）：1939-1941.

［6］赵琪，甄珍.单核细胞增生李斯特氏菌MPN法结果测量不确定度评定［J］.中国口岸科学技术，2022，4（5）：77-81.

（栏目编辑：董清芝）