基于关联分析挖掘小麦SDS 沉降值相关候选基因及KASP 标记开发

摘要：SDS沉降值是小麦品质育种的一项重要指标。对145份小麦品种的SDS沉降值进行了全基因组关联分析，在染色体3DL 末端鉴定到成簇的显著信号，结合peak SNP 的位置与LD 衰减距离锁定587.514～589.514 Mb为候选区段；利用重测序数据（http：//wheat.cau.edu.cn/WheatUnion/）发掘该区段内候选基因的变异位点，再对SDS沉降值的候选基因进行关联分析。综合关联结果、基因注释和基因表达分析，获得沉降值相关候选基因TraesCS3D03G1092400，命名为TaAGAP-3D。基于该基因的多态性SNP位点开发了可供育种利用的KASP标记Sv-3D-KASP，发现TaAGAP-3D（C）为SDS沉降值相关的优异等位变异。研究结果将为小麦SDS沉降值的遗传改良提供有效分子标记，同时也为进一步克隆品质基因提供参考。

关键词：小麦；SDS沉降值；全基因组关联分析；候选基因关联分析；KASP标记doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0895

中图分类号：S511 文献标志码：A 文章编号：10080864（2024）12001812

小麦（Triticum aestivum L.）是世界上重要的粮食作物之一，在全球各地广泛种植，以小麦为主要口粮的人口占世界总人口的35%～40%[1]。随着生活水平的提高和消费结构的转变，人们更趋向于营养、丰富和健康的饮食消费。因此，培育优质专用小麦已成为现阶段小麦育种的重要目标。十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）沉降值是小麦品质育种的一项重要指标[2]，其与蛋白质含量、湿面筋含量和稳定时间等呈显著正相关[3]，同时SDS沉降值是由多基因控制的数量性状，具有较高的遗传力，能够用于育种早代选择[45]。

关联分析（association analysis），又称为关联作图（association mapping）或连锁不平衡作图（linkagedisequilibrium mapping），其基于基因位点间的连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）进行群体内基因型与表型的相关性分析，以此来确定与目标性状密切相关的基因位点或标记位点[6]。根据基因型鉴定范围的不同可将关联分析分为全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）和候选基因关联分析（candidate gene association study，CGAS）[7]。

随着高通量测序技术的发展以及模型的更新，GWAS已成为解析作物复杂数量性状的有力工具。席甜甜等[8]通过对337份小麦品种籽粒相关性状进行GWAS，定位到49个稳定的显著单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点。董一帆等[9]利用90K SNP芯片对259份小麦品种的沉降值、蛋白质含量等品质性状进行GWAS，检测到44个显著关联位点。CGAS是进行候选基因挖掘和功能验证的一种有效手段，可以借助前人的QTL作图、表达谱等研究结果，优先选择与目标性状相关的候选基因，结合表型数据、群体结构等进行候选基因关联分析[10]。Ehrenreich等[11]基于275份拟南芥材料对51个开花时间相关基因进行关联分析，进一步鉴定到2～10个与开花时间显著相关的基因，其中CO 基因是最可能的候选基因。Wilson等[12]对玉米籽粒淀粉含量相关的6个候选基因进行了关联分析，发现这些基因分别影响籽粒组分性状、淀粉糊化特性和直链淀粉水平。上述结果表明，CGAS是候选基因挖掘及基因功能验证的重要方法。

本研究以145份小麦品种为材料，结合重测序数据和多年多点SDS沉降值表型数据进行全基因组关联分析，挖掘相关候选区段，进一步通过候选基因关联分析筛选目标基因，根据目标基因的差异位点开发竞争性等位基因特异性PCR（kompetitiveallele-specific PCR，KASP）标记，并设计衍生限制性内切酶多态性标记（derived cleaved amplifiedpolymorphic sequences，dCAPS）加以验证，为小麦品质基因克隆及分子机制解析提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与田间试验设计

本研究以实验室构建的145份重测序自然群体为材料，包含100份育成品种，25份地方品种和20份国外引进品种[13]。试验材料分别种植在中国农业科学院作物科学研究所新乡试验基地（113°54′ E，35°18′ N）和中国农业科学院作物科学研究所顺义试验基地（116°65′ E，40°13′ N）。每份材料种植4行，行长2 m，行距25 cm，人工点播，每行播种40粒。田间管理依据当地农业生产实际进行管理，材料成熟后选取中间两行全株收获并脱粒晒干。

本研究试验材料的鉴定环境包括2018/2019年河南新乡（E1）、2019/2020 年河南新乡（E2）、2019/2020年北京顺义（E3）、2020/2021年河南新乡（E4）、2020/2021 年北京顺义（E5）、2021/2022年河南新乡（E6）、2021/2022 年北京顺义（E7）以及上述7个环境的最佳线性无偏估计（best linearunbiased prediction，BLUP）。

1.2 微量SDS 沉降值测定

将待试样品按GB5497—1985[14]定温定时法测定面粉含水量。用80 目筛旋风磨（型号Cyclotec 1093，FOSS公司，德国）将小麦磨成全粉，参照马传喜等[5]方法测定微量SDS沉降值。具体步骤如下：称取全麦粉2 g，装入35 mL的专用带塞试管中，加入16.7 mL溴酚蓝溶液，充分混匀后放置到沉淀值测定仪（型号Y15，YUCEBAS公司，土耳其）上摇5 min；取下试管再加入16.7 mLSDS-乳酸混合液（称取20 g SDS，加入20 mL乳酸储备液，用水溶解并定容至1 L），充分摇匀，放置到测定仪上摇5 min；取下试管竖立静止放置5 min，记录试管中沉淀体积。

每个样品2次重复，取其平均值。以面粉含水量14%（质量分数）湿基计算沉降值（mL），公式如下。

1.3 表型数据统计

采用IBM SPSS Statistics 27.0 软件（https：//www.ibm.com/spss）和Microsoft Excel 2021对表型数据进行t 检验、方差分析和基本描述性统计。利用R语言“lme4”程序包[15]计算BLUP值，以基因型为固定效应、环境为随机效应，计算遗传力（公式2）。通过R语言绘制不同环境下SDS沉降值的频率分布图和相关性分析图。

1.4 全基因组关联分析

基因型数据来自实验室前期获得的重测序数据[13]，本研究利用VCFtools-1.15对其进行质控，共鉴定到37 466 916个高质量的多态性SNP位点。质控参数为--minGQ 8 --minDP 12 --max-missing 0.9 --maf0.05 --min-alleles 2 --max-alleles 2。群体结构、LD衰减距离及主成分分析等参照已发表结果[13]，即群体结构和主成分均为3，LD衰减距离为2 Mb。

全基因组关联分析采用GEMMA（genomewideefficient mixed-model association）软件的混合线性模型（mix linear model，MLM）[16]，利用Q+K矩阵矫正群体结构和亲缘关系的影响。为了进一步控制假阳性，显著性阈值设定为Plt;1.0×10-6。

通过R语言将关联分析的曼哈顿图和Q-Q图进行可视化。通过LDBlockShow v1.39 软件[17]统计区段内变异位点的连锁不平衡程度并绘制热图。基于expVIP8（http：//www. wheat-expression.com/）分析基因表达模式。

1.5 候选基因关联分析

在显著关联候选区段发掘的基础上，利用实验室前期的重测序数据[13]（http：//wheat.cau.edu.cn/WheatUnion/）查询区段内所有候选基因的序列变异（包含上下游及3’/5’-UTR区的变异），提取全部变异位点作为基因型数据。候选基因关联分析使用GAPIT v3.0包（genomic association and predictionintegrated tool version 3.0）[18]的贝叶斯信息与连锁不平衡迭代嵌套式模型（bayesian-information andlinkage-disequilibrium iteratively nested keyway，BLINK）[19]。依据Bonferroni 方法，以Plt;1.0×10-4 为阈值判定SNP标记与目标性状显著关联。

1.6 KASP 标记开发与验证

根据候选基因显著关联位点设计特异性KASP引物（WheatOmics v1.0网站，http：//wheatomics.sdau.edu.cn/），包含2条带有荧光接头的分型上游引物F1-FAM 和F2-HEX 以及1 条通用下游引物Common-primer-R，引物序列见表1。KASP引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，反应在384孔荧光定量PCR板上进行。混合反应体系5 μL∶2.2 μL DNA（20～40 ng·μL-1），2.5 μL KASP Mastermix 和0.3 μL Primer mix（F1-FAM、F2-HEX、Common-primer-R分别3.0、3.0、7.5 μL，利用ddH2O加到25 μL）。PCR扩增程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性20 s，62 ℃退火40 s，10个循环；95 ℃变性20 s，58 ℃退火40 s，37个循环；28 ℃读板 1 min。采用QuantStudioTM 7 Flex 荧光定量仪（appliedbiosystems by life technologies）对扩增产物进行荧光信号检测，QuantStudioTM Real-time PCR Software v1.3（applied biosystems by life technologies）软件实现数据的可视化及结果判读。通过OriginPro 2024软件（https：//www.originlab.com/）对KASP 变异与SDS 沉降值的箱线图进行可视化。

1.7 dCAPS 扩增与酶切

为了验证KASP标记的有效性，进一步利用dCAPS Finder 2.0网站（http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）设计特异性dCAPS引物，包含一轮特异性正向引物dCAPS-F1 和反向引物dCAPS-R1（表1），该引物扩增包含变异位点的585 bp PCR产物。第2次PCR时，在SNP位点上游引入GA变异，包含特异性正向和反向引物dCAPS-F2 和dCAPS-R2（表1），并形成内切酶Sal Ⅰ的识别位点“GTCGAC”。利用内切酶Sal Ⅰ对二次PCR产物进行酶切，酶切产物在4%的琼脂糖凝胶中电泳。

具体的实验步骤如下：首先进行一轮PCR，反应体系为DNA（50 ng·μL-1） 2 μL，2×Mix 10 μL，dCAPS-F1 （10 μmol·L-1） 1 μL， dCAPS-R1（10 μmol·L-1） 1 μL，加ddH2O补至20 μL。PCR扩增程序如下：95 ℃变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min，12 ℃保温。然后，将一轮PCR 产物稀释200倍作为二轮PCR的模板，引物为dCAPS-F2和dCAPS-R2，使用2×Mix进行二轮PCR，体系及扩增程序同上。利用内切酶Sal Ⅰ对二轮PCR产物进行酶切孵育，孵育条件为37 ℃，4 h。反应体系为：PCR 产物5 μL，10×Buffer 1 μL，限制性内切酶0.2 μL，ddH2O补至10 μL。最后，酶切产物在4%的琼脂糖凝胶电泳（120 V稳压电泳20 min）。

2 结果与分析

2.1 SDS 沉降值表型变异分析

145份供试材料多年多点的SDS沉降值基本描述性统计分析结果如表2所示。可以看出，不同环境下SDS 沉降值的变异系数在14.15%～19.30%，其广义遗传力为94.10%，这表明SDS 沉降值主要受遗传因素影响，供试材料间存在较丰富的遗传变异。SDS沉降值的偏度和峰度绝对值均小于1，且频率分布直方图均呈现出正态分布（图1），表明SDS沉降值是由多基因控制的数量性状，适用于后续的关联分析。相关性分析（图1）发现，环境间的SDS沉降值呈极显著正相关，相关系数在0.47～0.94（Plt;0.001）。

2.2 SDS 沉降值全基因组关联分析

基于质控后的重测序基因型数据，利用GEMMA软件的MLM模型对多环境下的SDS沉降值进行全基因组关联分析。根据LD衰减距离，将peak SNP位置前后1 Mb设定为候选区段。在3DL末端发现成簇的显著信号（Plt;1.0×10-6），参照peakSNP的物理位置，锁定587.514～589.514 Mb为候选区段（图2A）。该区段内变异位点的连锁不平衡分析发现（图2B），多个LD区域与显著位点强连锁，进一步表明该区段与SDS沉降值存在较强的关联性。基于WheatOmics v1.0 网站（http：//wheatomics.sdau.edu.cn/）查询发现，该区段包含28个高置信基因，其中通过expVIP 数据库（https：//www.wheat-expression.com/）预测显示9个基因在籽粒中表达（图2C）。

2.3 3DL 末端区段候选基因关联分析

利用重测序数据（http：//wheat. cau. edu. cn/WheatUnion/）查询28个高置信基因的变异位点，其中21个基因存在变异位点，获得1 473个SNPs。结合多年多点的SDS沉降值表型数据，利用GAPITv3.0包的BLINK模型进行候选基因关联分析，结果（图3A、B）表明，6 个SNP 位点显著关联（Plt;1.0×10-4），其中1个位点在4个环境下均显著关联（图3A、表3）。进一步对关联位点进行注释，4个位点为启动子上游，5’-UTR和编码区变异，而其他2个位点为内含子变异（图3A，表3）。有趣的是，这6个关联位点分别位于6个基因上，这些基因的表达量分析发现仅有3个基因在籽粒中表达。结合表达量分析和变异位点注释，初步锁定TraesCS3D03G10-92400 和TraesCS3D03G1089600 为候选基因。基因注释表明TraesCS3D03G1092400 编码GTP相关的激活蛋白（Arf GTPase activating protein），而TraesCS3D0-3G1089600 编码绒毛蛋白（Villin）。综合上述结果，推测TraesCS3D03G1092400 为SDS沉降值的候选基因，并将其命名为TaAGAP-3D。

2.4 TaAGAP-3D 基因KASP 标记开发与验证

根据TaAGAP-3D 编码区上SNP 的两种变异类型（C/T）（图A），开发了有效区分它们的KASP标记Sv-3D-KASP（图B）。为了进一步验证KASP标记的准确性，同时设计了dCAPS 标记Sv-3DdCAPS-1（图4C），该标记的分型结果与KASP 标记基本吻合（表4）。进一步结合多年多点的SDS沉降值数据验证KASP标记的遗传效应，发现在大多数环境下TaAGAP-3D（C）型材料的SDS 沉降值显著高于TaAGAP-3D（T）型材料（图4D），表明TaAGAP-3D（C） 是SDS 沉降值相关的优异等位变异。

3 讨论

3.1 小麦3D 染色体上沉降值关联区段的多效性分析

小麦是异源六倍体作物，与A、B亚基因组相比，其D亚基因组的遗传多样性严重匮乏，是小麦品种改良的重要瓶颈[2021]。本研究在3D染色体的末端定位到1个SDS沉降值候选区段，其物理位置为587.523～589.514 Mb。陈华斌[22] 利用90KSNP芯片鉴定272份小麦材料，结合蛋白质含量进行了全基因组关联分析，发现在3DL末端检测到多个显著位点（IWB18421、IWB42714、IWB6798、IWB2250 和IWB58810），其物理位置相近，分别为596.089、596.718、596.916、596.916 和609.626 Mb；基于全基因组LD衰减距离18.3 Mb，该研究将这些位点划分到了同一QTL区段，而该区段涵盖了本研究鉴定到的位点。彭小爱等[23]对118份小麦材料的55K SNP芯片基因型数据和容重进行全基因组关联分析，在3个环境下均定位到了3D染色体上的显著关联位点AX-108887454，其物理位置为590.04 Mb；基于作者报道的8 Mb全基因组LD衰减距离，该候选区段同样包含了本研究定位到的区段。这些结果表明本研究鉴定的3DL末端区段可能控制多个品质性状，其遗传基础有待进一步深入解析。

3.2 联合多种关联分析缩小候选区段及预测候选基因

全基因组关联分析（GWAS）是对全基因组范围内的基因型与表型进行关联分析的方法，根据成簇的显著信号及LD衰减距离定位候选区段[24]。而候选基因关联分析（CGAS）则通过目标区段内候选基因的变异位点与表型展开关联分析，利用统计分析挖掘与目标性状相关的基因或功能位点[25]，从而进一步筛选候选基因。前人的研究大多数仅考虑使用GWAS或CGAS单一方法鉴定候选区段或基因，如Wen 等[26]利用重测序技术对121份棉花种质资源进行GWAS，检测到与株高和果枝数量相关的11 个QTLs；Setter 等[27] 对玉米540个基因的1 229个SNP进行候选基因关联分析，发现一些基因的SNP与糖和脱落酸相关。前人也联合GWAS与其他组学分析进行共定位以缩小候选区段和预测候选基因，如Tang 等[28]结合GWAS和转录组分析来解析505份甘蓝型油菜含油量的遗传基础，通过GWAS鉴定到27个与含油量显著相关的QTLs后，进一步利用转录组分析锁定了候选基因；Anacleto等[29]联合GWAS和转录组关联分析（transcriptome-wide association study，TWAS）对305 份籼稻的血糖生成指数（glycemicindex，GI）进行分析，GWAS在 6号染色体上鉴定到1 个与GI 性状相关且包含26 个基因的区段，TWAS分析进一步将该区段内的候选基因缩小至13个。本研究通过联合GWAS和CGAS有效缩小了与SDS沉降值相关的候选区段并预测了候选基因（图2A和3A）。因此，全基因组关联分析联合其他多种分析方法如候选基因关联分析，可以更有效地发掘作物重要农艺性状基因。

本研究预测的候选基因TraesCS3D03G1092400 被注释为ARF-GTP酶激活蛋白，关联分析表明该基因与SDS沉降值相关。鉴于水稻中已克隆了1个具有相同注释的基因OsAGAP[30]，因此将其命名为TaAGAP-3D。研究表明，OsAGAP 能够调节生长素内流、囊泡运输和根发育[31]；并且在小麦中发现GPC-B1 编码NAC转录因子（NAM-B1），RNA干扰后延迟衰老并使小麦籽粒的蛋白质、锌和铁含量降低30%以上[32]。综上所述，推测TaAGAP-3D可能响应生长素调节信号使营养物质进行再分配，其基因功能和分子机制有待通过多种分子生物学方法进一步研究。

3.3 小麦品质相关KASP 标记开发与应用

随着分子生物技术的快速发展，分子标记辅助选择已经成为现代分子育种的有效工具[33]。基于SNP的KASP基因分型技术具有灵活性强、高通量、成本低及操作简单高效等特点，在分子标记辅助选择育种中得到广泛的应用。在小麦中，KASP技术多用于抗病和耐非生物胁迫相关基因的研究[34]，而在品质方面的分子标记还较少。魏广源等[35]通过硒含量相关的SNP位点开发KASP标记AX-1和AX-2，该标记能够有效区分高硒和低硒籽粒样品并用于高硒小麦选育。Liu等[36]基于Gli-γ1-1D 的2种主要单倍型（Gli-γ1-Ⅰ和Gli-γ1-Ⅱ）开发了KASP标记，206份小麦材料基因型鉴定发现携带Gli-γ1-Ⅰ材料的SDS沉降值显著高于携带Gli-γ1-Ⅱ材料，这为Gli-γ1-Ⅰ在小麦品质分子育种中的利用提供了可靠标记。毕俊鸽等[37]针对QTL定位到的与籽粒蛋白质含量相关的候选基因开发了2个KASP标记并在166份国内外小麦材料中进行验证，用于筛选高籽粒蛋白质含量的优异资源。本研究基于TaAGAP-3D 多态性SNP 位点开发了KASP 标记Sv-3D-KASP，并发现TaAGAP-3D（C）为SDS沉降值相关的优异变异，将为小麦品质分子标记辅助育种提供新基因和新标记。

参 考 文 献

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