中药对皮肤浅部真菌抑菌试验及活性检测方法的应用进展

[摘 要] 中医药作为我国民族特色的瑰宝，在抑制真菌生长、杀灭病菌方面发挥着重要作用。具有对抗皮肤浅部真菌作用的中药有数百种，根据不同的实验目的选取不同的中医药抑菌试验方法，以及对其真菌活性的检测已经成为临床研究的高频热点。本文通过收集、整理、分析国内外相关文献，系统归纳常用的中药抑菌试验方法以及活性检测方法，以期为中医药抑菌方法的选择提供新思路。

[关键词] 中药；皮肤浅部真菌；抑菌试验；活性检测

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1004-4949（2024）11-0180-04

基金项目：贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究课题（编号：QZYY-2023-036）

Application Progress of Bacteriostatic Test and Activity Detection Method of Traditional Chinese Medicine on Superficial Fungi in Skin

DENG Ji-qing1，2， WU Ran3， YUAN Fang-cao1， TANG Shan-shan1

（1.The First Clinical Medical College， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550000， Guizhou， China； 2.Bijie Medical College， Bijie 551700， Guizhou， China； 3.Department of Dermatology， the First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550000， Guizhou， China）

[Abstract] As a treasure of Chinese national characteristics， traditional Chinese medicine plays an important role in inhibiting the growth of fungi and killing bacteria. There are hundreds of traditional Chinese medicines that have the effect of anti-skin superficial fungi. According to different experimental purposes， different antibacterial test methods of traditional Chinese medicine are selected， and the detection of its fungal activity has become a high-frequency hot spot in clinical research. By collecting， sorting and analyzing relevant literatures at home and abroad， this paper systematically summarizes the commonly used antibacterial test methods and activity detection methods of traditional Chinese medicine， in order to provide new ideas for the selection of antibacterial methods of traditional Chinese medicine.

[Key words] Traditional Chinese medicine； Superficial fungi in skin； Bacteriostatic test； Activity detection

中医药是传统医学的宝贵经验传承，究其药用源流，至今已历经千载。在中医药现代化发展的今日，许多中草药的抑菌抗炎效果经过现代临床药理学都得到了验证，研究证实中草药具有抑菌谱广、毒副作用小、作用机制多、不易产生耐药性等特性[1]。故研究中医药的抑菌性能，通过不同的实验目的，选择合理的试验方法，并对其抑菌活性进行科学的评判具有重要意义。

1 抑菌试验方法的应用

1.1 体外抑菌敏感实验方法

1.1.1纸片法 纸片法也被称作纸片扩散法、抑菌圈法，是将含有抑菌药物的滤纸片粘贴在已吸收所测试菌种的琼脂上，通过观察纸片中药物的扩散范围，测量抑菌圈的大小来确定药物敏感性。纸片法目前被公认为是一种权威的用药指导依据，但由于该方法只能定性，因此纸片法通常被用来做药物敏感性试验，且该方法的缺点是试验结果易受多因素影响，如培养基的质量与厚度、药物扩散程度、接种菌量及菌活力、孵育培养条件等。Orbán-Gyapai O等[2]通过该法对分离蓼科植物的化合物进行了抑菌活性测定，结果表明，当中萘类化合物对葡球菌、毛癣菌等几种菌群具有显著的抑制作用。

1.1.2牛津杯法 牛津杯法又称管碟法，是指向已灭菌的牛津杯中注入特定剂量的检测品，通过培养后，测定抑菌圈大小的一种检测手段。在目前中医药抑菌研究方面，该法可作为筛选抑菌中草药的常用试验方法。该法的缺点在于由于待测样的抑菌效果不同，因此抑菌圈的大小也会不同，如检测目标为浓度过高的中药，扩散时容易产生不均匀播散，故显示的抑菌圈则出现不规则表现。彭璐等[3]通过牛津杯法，观察到百药煎比生五倍子抑菌圈更大，结果具有显著性差异，表明百药煎的抗菌效果比生五倍子更强。

1.1.3微量二倍稀释法 在抑菌实验中，为了评判某种药物的抗菌功效，最低抑菌浓度（MIC）是非常重要的指标，利用二倍稀释法可以得到MIC值。该法相比以往的其它稀释法，其优点在于不仅所需的培养量及菌量都较少，而且可以在同一观测平板上同时观测多种药物浓度对所选真菌的抑制情况。如于芯宜等[4]采用二倍稀释法研究丁香、薰衣草、桉叶、香茅、肉豆蔻5种精油的体外抑菌活性，结果显示该5种精油抑菌MIC活性从大到小依次为桉叶=香茅>薰衣草=肉豆蔻>丁香。目前，微量二倍稀释法是筛选中草药抑菌最常用的方法。

1.1.4 Etest法 Etest法是一种基于纸片扩散法与MIC检测相结合的方法，该方法结合了纸片扩散法操作方便、结果易读取及可直接获得MIC值的优势。相比常规的药敏试验，Etest法的结果更加准确，因为该法可以提供连续的抗生素浓度梯度，且Etest法的操作更加简单。张丽等[5]通过Etest方法与微量肉汤稀释法进行对比，通过试验得出Etest法在中药抑菌药物敏感性评价中优于传统微量肉汤稀释法。

1.1.5自动化药敏检测系统 自动化药敏检测系统的优点是可以迅速、精准地确定微生物对抗生素的敏感性，该系统可以自动化执行测试，从而减少了人工操作的错误和变异性。然而，该系统价格昂贵，需要专业人员进行操作和维护，因此该方法在常规体外抑菌试验中选用较少。

1.1.6平皿法 平皿法主要有打孔、挖沟法。打孔法是指用已灭菌的打孔工具在试验平板上打孔、培养，观察测定抑菌圈大小的一种方法。与其他抑菌试验方法相比，打孔法操作简单、快捷，得出的抑菌圈质量高，可多次复制。缺点是在打孔时，如果用力不当，会破坏孔的规则感，导致抑菌圈形状不一。挖沟法是在琼脂平皿中间挖1条沟，加入待测药液后再划一条垂直药沟的接种线，每个平皿可同时检测同一菌种，该法可同时试验多种菌种，且操作简单，缺点是测试时间长，结果可能受到人为因素的影响。例如，挖沟的深度和宽度可能会影响结果。该法可筛选不同中药成分的抑菌活性，而在具体抑菌实验中，对于难溶于液体中的中草药一般选用该方法。

1.1.7菌落计数法 菌落计数法是一种统计菌含量的有效方法，常用于如抑菌制剂、生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。其原理是适当稀释待测菌液，使菌液中菌落充分散成单个细胞形态，随后取一定含量的菌样液均匀涂布在培养基上，可观察到菌液中每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个活菌。这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。缺点是过程较繁，而且常受多种因素的影响。田莹等[6]通过菌落计数法和显微镜观察计数两种传统方法与实时生物气溶胶监测技术进行比对，结果发现以上方法均具有较好的一致性。

1.1.8比浊法 比浊法主要通过药液浊度来观察药物对所测菌群的抑菌敏感性，邓书武等[7]通过研究金花茶叶水提物不同极性部位对白色念珠菌等的体外抑菌效果，经过多次的预实验发现测定的浓度太浓，透光率低，不好肉眼观察，而如果测定的浓度太稀又检测不出抑菌效果，故测试浓度的高低会对试验结果产生影响。

1.2 体内抑菌试验 体内抑菌试验最主要的试验方法，是在动物体内进行，和体外抑菌试验相比更接近生理情况，实验结果能更直接表示出抑菌程度及对机体的实际影响，结果更具有说服力。但是动物实验需要事先制备，术后还需护理，待动物恢复健康后才能开展，花费时间较长，工作量较大，因而在选用上受到一定限制。该方法的缺点是难以建立完全统一的动物模型，由于不同机体免疫情况不同，可能导致同一染菌量呈现出不同的致病效果[8]。朱怡萱等[9]通过正交试验筛选出组方最佳配比，通过马腺疫小鼠模型体内抑菌试验筛选加味组方，成功优选出1种对马链球菌马亚种具有良好抑菌、组织保护作用的中药组方。体内抑菌试验除了动物体内抑菌试验以外，其替代方法有很多，例如体外细胞培养[10]、计算机模拟[11]等。这些方法虽然不能完全取代动物实验，但可以在一定程度上减少动物实验的数量，降低动物实验对动物的伤害。

2 真菌活性检测方法

2.1 形态学检测 真菌在抑菌试验后的形态学检测方法通常选用直接镜检，而镜检又包含光学显微镜检测、扫描电镜检测与投射电镜下检测等，传统光学显微镜只能获得大视野的全貌信息，扫描电镜则能获取较高分辨率的真菌表面结构信息，而透射电镜则可以分析生物微结构以获取高分辨率的真菌内部结构信息。林琳等[12]利用扫描电子显微镜可观察到白色念珠菌的表面结构，如经过鹅掌疯醋剂处理的菌体细胞表面出现粗糙、皱缩、萎陷、细胞质内容物渗漏，而光学显微镜组只能观测用药前后菌丝密度有无变化。因此，扫描、透射电镜的作用是可以对中药抗真菌的作用机制进行初步探索。

2.2 分子实验室检测 PCR技术是一种体外扩增DNA的方法，它可以将极微量的目标DNA特异地扩增上百万倍，从而提高对DNA分子的分析和检测。其应用于真菌活性检测方面是通过分子层面，分析中药活性成分最主要是通过某些关键的基因表达来达到抑制真菌的作用机制[13]。

2.2.1聚合酶链式反应（PCR） PCR技术除了应用于真菌等病原体的鉴定中，还适用于基因靶点测定与分析。该法简便、快捷、成本低、稳定性好、结果可靠，适合在今后的检测中常规使用，所用试剂和仪器相对简单，价格相对低廉，特异性敏感性高。该法的主要缺点是需要大量的DNA样本。于冰[14]等研究中药活性成分丁香酚在真菌性角膜炎治疗中的作用和机制，并采用PCR测定小鼠角膜中IL-1β、TNF-α的逆转录基因表达。

2.2.2实时荧光反转录聚合酶链反应（RT-PCR）RT-PCR是第二代PCR方法，该法能够定量样本中的DNA分子数量，从而定量病原体[15]。梁妍[16]通过RT-PCR测定吴茱萸碱抑菌活性以及该中药成分抗麦角甾醇生物合成途径机制，发现了吴茱萸碱在影响麦角甾醇合成途径通路上的一些重要基因表达。

2.2.3数字聚合酶链反应（dPCR） 数字PCR（dPCR）被称作第三代PCR技术，是因其对比常规PCR、实时PCR而言，具有定量、样品量低、高敏等优势。缺点是通量不高、操作复杂，同时成本大大增加。Alikian M等[17]研究表明，在慢性粒细胞白血病患者的检测中，定量分析结果可靠性高、重复性好。

相对于RT-PCR需要加入特异性的荧光分子探针，PCR-RFLP需要特异酶切处理，常规PCR所用试剂和仪器相对简单，价格相对低廉，特异性敏感性高，是一种较经济实惠的检测方法。

3 基因组学检测（高通量测序）

高通量测序技术又称为深度测序技术，具有通量高、读长相对较短、单位数据成本极低等优点。该项技术在真菌作用机制、耐药基因演化分析、高频变异基因检测方面已经得到了广泛的应用。黄彬彬等[18]基于高通量测序技术分析25例特应性皮炎患者皮肤菌群样本，证实特应性皮炎患者皮损处真菌多样性高于非皮损处以及正常人，进一步佐证由马拉色菌属诱导的AD会产生多种免疫原性蛋白质，这些蛋白质会引发特异性IgE抗体的产生，并可能诱导促炎细胞因子的释放，导致AD形成的可能机制。段妍等[19]通过高通量测序技术研究发现中药合剂可以下调Pdrlp和Pdr3q这两种基因的表达，该两种转录因子具有调节耐药性的作用，通过上调破坏真菌细胞膜和细胞核的相关基因的表达[20]。

4 总结

在选用不同的抑菌试验及真菌活性检测方法时，应通过自身的试验目的进行选择。进行中药药敏测试，可以选择纸片扩散法、牛津杯法、微量二倍稀释法、Etest法及自动药敏检测系统等方法。因纸片扩散法易受多因素影响，选用含挥发油成分的中药检测，就不宜选用纸片扩散法，应选用平皿法及菌落计数法等，以免有效成分丢失。试验对象为较高浓度中药时则不宜采取牛津杯法，但可以选用比浊法。Etest法则兼备抑菌的定性与定量分析，故此在中药抑菌测定中，可优先考虑该法。如要筛选具有抑菌功效的试验方法，微量二倍稀释法仍是首选。若需观察中药的抑菌效果，则可以选用平皿法、菌落计数法、比浊法等，但比浊法主要用于中药水、醇提取物等液体浓度来进行观测。如观测中药对机体抑菌程度的实际影响则可选用动物造模试验。此外，想更进一步检测真菌在中药处理后的微生物状态、分子形态、表面及内部构造以及中药对真菌的作用机制、基因靶点等分析，可以选用形态学检测、分子实验室检测、基因组学检测（高通量测序）等手段，从而实现一个较为完整的研究过程。

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收稿日期：2024-4-9 编辑：吴含