产植酸酶益生乳酸菌的筛选

摘要：【目的】分离筛选产植酸酶益生乳酸菌菌株。【方法】以发酵饲料、博扎、浆水为代表的发酵样品中，分离筛选出形态差异菌株，通过产酶筛选及16S rDNA分子鉴定，获得产植酸酶乳酸菌菌株，并通过耐酸、耐胆盐、耐肠胃液、自聚集力及抑菌分析对其进行评价。【结果】筛选出4株产植酸酶乳酸菌，其中菌株JS5植酸酶酶活高达0.83 U/mL，与植物乳杆菌菌株 DSM 20174相似性为100%，确定该菌株为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）。菌株JS5在pH值3条件下存活率高达100%，在胆盐浓度0.1%时JS5存活率为0.55%，在模拟肠液和胃液中，存活率分别为8.56%和0.38%，其活菌数均在1×106CFU/mL以上，达到发挥益生作用的最小活菌数要求。菌株JS5自聚集力为（9.69%±0.44%），可促进菌株在肠道定殖。菌株JS5发酵液对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌均有抑制作用。【结论】植保乳杆菌JS5产植酸酶较高，可在模拟肠胃液中存活，具有良好的细胞黏附能力和抑制病原菌生长，可用于益生的畜禽微生态制剂。

关键词：乳酸菌；植酸酶；筛选

中图分类号：S188文献标志码：A文章编号：1001-4330（2024）09-2290-10

0引 言

【研究意义】植酸酶是将植酸（肌醇六磷酸）或植酸盐水解为肌醇、磷酸或磷酸盐的一类酶的总称［1］。植酸通常与钙、铁、磷等矿物质元素结合，形成不溶性盐类，还可以络合蛋白质，减少其与消化酶的接触及抑制消化酶的活性［2，3］，过高的植酸将降低饲料的转化率，动物饲粮中的磷主要以植酸的形式存在，限制了饲料中营养物质利用。由于单胃动物不能分泌植酸酶，因此饲料外源中必须添加足量的植酸酶［4］。【前人研究进展】在家禽饲粮中特别是低有效磷饲粮添加植酸酶可提高生产效益［5，6］。乳酸菌及其制品可调整肠道微生态平衡、提高饲料的利用率。【本研究切入点】关于微生物产植酸酶报道虽多，如曲霉［7，8］、芽孢杆菌［9，10］等，但有关乳酸菌产植酸酶的研究较少。乳酸菌具有调节免疫、修复肠道菌群益生功能和培养方式简单，产胞外酶易获取等优点，为推进相关产品的开发，需对乳酸菌进行定向筛选，获得优良菌株。【拟解决的关键问题】以发酵饲料、博扎、浆水为代表的发酵样品中，筛选耐胃酸、耐胆盐、耐肠胃液，且具有良好细胞黏附及抑制病原菌能力的产植酸酶乳酸菌。

1材料与方法

1.1材 料

样品：博扎、浆水、发酵饲料样品。

植酸钠琼脂培养基：葡萄糖20 g/L、植酸钠4 g/L、氯化钙2 g/L、硝酸铵5 g/L、氯化钾0.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、硫酸铁0.01 g/L、硫酸锰0.01 g/L和琼脂15 g/L［11］。

产酶培养基：酪蛋白胨10 g/L、牛肉浸取物4 g/L、酵母提取物2 g/L、葡萄糖10 g/L、乙酸钠5 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、吐温-80 1 g/L、半胱氨酸0.05%（w/v）、植酸钠0.65 g/L、MOPS 0.1 mol/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、碳酸钙20 g/L和琼脂15 g/L，调pH值5.0～5.5［12］。

MRS培养基：酪蛋白胨10 g/L、牛肉浸取物8 g/L、酵母浸粉4 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、乙酸钠5 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.04 g/L、吐温-80 1g/L，调pH值（5.7±0.2）。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L，调pH值（7.0±0.2）。

1.2方 法

1.2.1试验设计

称取不同来源的材料（博扎、浆水、发酵饲料）各10 g，与90 mL无菌生理盐水振荡混合，10倍梯度稀释成不同浓度的菌悬液，取10-4、10-5、10-6稀释度各100 μL分别涂布MRS平板中挑选形态差异菌株。取纯化后的菌株在MRS肉汤37℃培养24 h后，将菌悬液（3 μL）点接在改进后的植酸钠琼脂培养基上，30℃培养7 d。植酸酶阳性菌落的周围形成透明圈，挑选出透明圈直径与菌落直径较大的菌株斜面保藏。

1.2.2测定指标

1.2.2.1标准曲线制作

取适量KH2PO4于105℃烘至恒重，称取0.272 g于500 mL容量瓶定容，获得4 μmol/mL的KH2PO4标准溶液。按照0.00、0.80、1.60、2.40、3.20、4.00 μmol/mL浓度梯度对KH2PO4标准溶液进行稀释，取定量稀释KH2PO4溶液与显色剂反应，以无机磷标准液的浓度为横坐标、吸光值（700 nm）为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2.2植酸酶酶活测定

挑取筛选出的菌株接种至产酶培养基，37℃培养24 h，通过离心（11 000 r/min，10 min，4℃）获得无细胞上清液用于测定胞外酶活。取50 μL上清液，加入200 μL 3 mmol/L溶解于pH值 5.0的醋酸缓冲液的植酸钠，55℃温育10 min，加入250 μL的5%（w/v）三氯乙酸停止反应。加入500 μL由4体积1.5%钼酸铵溶液与5.5%硫酸和1体积2.7%硫酸亚铁溶液混合制成的显色剂，室温反应10 min，测定700 nm吸光度，对照组先加入终止液再加入植酸钠溶液和显色液，计算被测样品中植酸酶的活力［13，14］。

酶活力 = cnvt（U）.

式中，c为反应混合物中植酸钠释放的磷酸盐浓度（μmol/mL）；n为稀释倍数；v为酶提取物体积（mL）；t为反应时间（min）。

植酸酶活性的一个单位（U）定义：在测定条件下释放1 μmol Pi/min所需的酶的量。

1.2.3产植酸酶乳酸菌鉴定

将保藏菌株活化两代并划线至MRS固体平板，37℃培养24 h，观察菌落形态。挑取单菌落涂布于载玻片上，采用革兰氏染色法镜检。使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，引物为27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’）与1 492R（5’-GGT-TACCTTGTTACGACTT-3’），以DNA为模板进行PCR扩增送新时代众合科技生物公司测序，菌株16S rDNA序列上传EzBioCloud进行分类鉴定。

1.2.4乳酸菌益生潜力的体外评价

1.2.4.1菌体悬浮液的制备

将菌种接种于5 mL MRS肉汤中，37℃静态培养24 h。将1%（v/v）的上述培养物转移到10 mL MRS培养液中，37℃培养24 h，培养后，离心（11 000 r/min，10 min，4℃）收集菌体，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH值 7.3）洗涤2次，并重新悬浮于其中［15］。

1.2.4.2耐酸性

将100 μL菌体悬浮液分别与900 μL PBS pH值2.0、3.0和7.3混合，37℃培养3 h，稀释取100 μL涂布在MRS琼脂平板上测定活菌数（CFU/mL）并计算存活率［15］。

1.2.4.3胆盐耐受性

将100 μL菌体悬浮液分别与900 μL胆盐浓度（0.0%、0.1%、0.2%和0.3%）MRS肉汤混合，37℃培养3 h，稀释取100 μL涂布在MRS琼脂平板上测定活菌数（CFU/mL）并计算存活率［15］。

1.2.4.4胃液耐受性

将100 μL菌体悬浮液分别与900 μL合成胃液混合（胃液由胆盐0.05 g；CaCl2，0.11 g；葡萄糖，3.5 g；KCl，0.37 g；KH2PO4，0.6 g；溶菌酶，0.1 g；NaCl，2.05 g；胃蛋白酶，0.013 3 g；胰蛋白胨，8.3 g；水1 L，pH值 2.5），37℃培养。在MRS琼脂平板上测定0和3 h的活菌数（CFU/mL）并计算存活率［15］。

1.2.4.5肠液耐受性

将100 μL菌体悬浮液分别与900 μL合成肠液混合（肠液由1 mg/mL胰酶（胰淀粉酶10 U/mg；胰脂肪酶20 U/ mg；胰蛋白酶4 U/mg），溶解于含有0.3%胆盐的0.85%（w/v）NaCl溶液中制备，pH值 8.0），37℃培养。在MRS琼脂平板上测定0和6 h的活菌数（CFU/mL）并计算存活率［15］。

1.2.4.6菌体的自聚集力

活化后培养的乳酸菌，取2 mL，11 000 r/min，4℃离心10 min，用PBS （pH值 7.3）清洗菌体2次，并将其稀释至OD=0.5 （600 nm）。将2 mL悬浮液轻轻涡旋10 s，37℃培养1 h。取出上部悬浮液，记录OD （600 nm）读数，计算自聚集力［15］。

A（%）=（1-ODy/ODx）×100.

式中，A为自聚集力，ODx为总菌悬液吸光度，ODy为上悬液吸光度。

1.2.4.7抑菌能力

将保藏的乳酸菌活化两代，接种至MRS液体培养基37℃培养72 h。将5种指示菌株大肠杆菌、沙门氏杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌分别接种到LB 液体培养基中，37℃培养24 h，以20 mL/L的量加入40℃ NA培养基中，凝固后打孔（7 mm）并每孔加入65 μL带菌发酵液和发酵上清液（11 000 r/min，10 min，4℃），37℃培养24 h，测定抑菌圈直径大小，判断乳酸菌的抑菌活性［16］。

1.3数据处理

采用Excel 2016和Origin 2021软件进行数据整理及图表绘制，通过IBM SPSS Statistics 20软件进行显著性和方差分析，显著性水平Plt;0.05。

2结果与分析

2.1产植酸酶菌株镜检形态鉴定

研究表明，从不同来源的材料（博扎、浆水、发酵饲料）分离纯化出37株菌株，得到具有植酸钠水解能力的菌株共22株，均为革兰氏阳性，其中球菌4株，杆菌18株。对符合乳酸菌形态的球菌、杆菌液体发酵进行胞外植酸酶测定，进一步筛选产胞外植酸酶较高菌株。图1，表1

2.2胞外植酸酶酶活测定

研究表明，准确配置4 μmol/mL KH2PO4标准溶液，将标准溶液稀释成0.0、0.8、1.6、2.4、3.2 μmol/mL的溶液。以无机磷含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。其回归方程为Y=0.106 6X+0.004 2，相关系数为0.999，在无机磷浓度为范围内，该方法可作为定量测定胞外植酸酶的方法。图2

2.316S rDNA基因序列同源性

研究表明，乳酸菌JS2、JS5、S1和J6植酸酶酶活分别为0.78±0.04、0.84±0.04、0.48±0.03和0.62±0.02。

初步鉴定JS5为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），JS2为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），J6为发酵乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum），S1为斯特拉斯堡乳植物杆菌 （Lactiplantibacillus argentoratensis），利用MEAG11，以Neighbor-joining法（1 000 bootstrap）构建系统发育进化树。图3

2.4模拟体外肠道条件下的存活率

2.4.1乳酸菌菌株的耐酸性能

研究表明，在pH值3条件下，3 h时4株乳酸菌的存活率范围在25.34%～100.00%，其中菌株J6存活率为95.69%，菌株JS5存活率高达100%，菌株JS5、J6均具有良好的耐酸性，能够适应模拟胃酸的环境。在pH值2条件下，只有菌株S1存活，且存活率下降至1.74%。试验筛选的菌株JS5、J6具有较好的耐酸性能。 图4

2.4.2乳酸菌菌株的耐胆盐性能

研究表明，选取4株乳酸菌在不同浓度的胆盐溶液中孵育3 h。在胆盐浓度0.1%条件下，3 h后4株乳酸菌的存活率下降。其中菌株J6、JS5存活率为0.86%和0.55%，对胆盐的耐受能力较弱，但活菌数仍保持在106CFU/mL以上，乳酸菌发挥益生作用的最低活菌数为106 CFU/mL。菌株S1、JS2不耐受胆盐，在胆盐浓度0.1%条件下不能存活。当胆盐浓度提高至0.2%时，4株菌株均不能存活，4株菌株胆盐耐受性较弱。4株乳酸菌对胆盐的耐受性较弱，可能与菌体内相关水解酶有关。表2

2.4.3乳酸菌菌株的耐肠液性能

研究表明，以人工肠液模拟菌株生长环境，6 h时观察4株乳酸菌的耐肠液能力。4株乳酸菌对模拟肠液均有一定的耐受能力，活菌数均在107CFU/mL以上。其中菌株J6、S1在模拟肠液中处理6 h后存活率较高，达到92.45%和51.92%，具有较高的耐受性。菌株JS5在肠液培养6 h后，存活率为8.56%，但活菌数达到1.13×108CFU/mL，高于存活率为92.45%的菌株J6。表3

2.4.4乳酸菌菌株的耐胃液性能

研究表明，菌株JS2、J6对人工胃液的耐受性较高，3 h后活菌数存活率为52.86%和27.66%。菌株JS5、S1耐受性低，存活率为0.38%和1.76%。其中菌株JS5在人工胃液中培养3 h后活菌数为6.33×106CFU/mL，在4株菌株中最低。表4

2.4.5乳酸菌菌株的自聚集力

研究表明，菌株JS2、JS5自聚集力较高，1 h后自聚集力为（9.95±0.54）%、（9.69±0.44）%。菌株J6、S1自聚集力较低，1 h后自聚集力为（6.12±0.70）%、（2.50±0.31）%。筛选的菌株JS2、JS5具有良好的自聚集力，具有在肠道中定殖的能力。图5

2.4.6乳酸菌菌株的抑菌性能

研究表明，菌株JS5、JS2、S1发酵上清液和菌液对5种致病菌均有抑菌作用，菌株J6发酵上清液对金黄色葡萄球菌没有抑菌作用，对大肠杆菌、沙门氏菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌有抑菌作用；菌株J6菌液对5种致病菌均有抑菌作用。其中4株乳酸菌2种不同处理中抑制大肠杆菌效果最佳为S1菌液；抑制沙门氏菌效果最佳为JS5发酵液；抑制金黄色葡萄球菌效果最佳为JS2菌液；抑制白色念珠菌效果最佳为S1菌液和发酵液；抑制铜绿假单胞菌效果最佳为J6菌液。不同菌株抑菌能力的差异可能与菌株所产的抑菌成分的种类和抑菌物质活性有关。表5

3讨 论

植酸酶是一种胞外酶，广泛存在于自然界中，在动物、植物、微生物中均有发现。其中动物植酸酶含量较低，难以大规模应用；

乳酸菌生长在pH值小于4.0的环境下会受到明显抑制［17］。胃液中盐酸是调节胃酸的主要成分，其pH值通常在3.0左右，在空腹情况下pH值可下降至2.5［18］。乳酸菌发挥益生作用的前提是能够在胃液中存活，只有具有良好耐酸能力的乳酸菌才能通过胃液发挥益生特性，食物在胃中消化时间，一般不会超过3 h，液体通过时间则更短［19］。王祎然等［19］研究6株菌的耐酸能力，在pH值2.5环境中，菌株存活率最低为88.17%，最高为94.48%。冯秀娟等［20］自26株乳酸菌中筛选出2株菌具有良好的耐酸性，在pH值 3.0的环境中能够培养生长，且在胁迫2h后有持续生长的趋势，存活率达到100%，食物经过胃液的消化后会进入十二指肠与具有抑菌作用的胆盐接触［19］。小肠中胆盐浓度一般为0.03%～0.3%，且胆盐可产生较高渗透压，会对菌体细胞造成影响，对细胞膜和DNA都有一定程度的损伤，可造成细胞的死亡［21］。一般食物经过需要3 h［22］，Sakandar［23］发现6株乳酸菌在0.3%的胆盐浓度中培养3h后的活菌数下降到106 CFU/mL。杨晓宇等［24］对6株乳酸菌研究发现，胆盐浓度达到3g/L时，存活率明显降低，平均为45%，其中存活率较高的可达69%。小肠内的pH值一般在7.6左右，食物在小肠内会停留 3～8 h，益生菌需定殖并存活在肠道内，耐肠液也是益生菌筛选的重要指标之一［25］。肠液主要成分为胰液和胆盐，胰液中的胰蛋白酶可水解微生物的菌体蛋白质，抑制微生物的生长，胆盐能改变微生物细胞膜的通透性，杀死进入肠道的微生物。因此益生菌要发挥益生功能，需要能耐受肠液中胰蛋白酶、胆盐等物质［26］。

程秀芳等［27］对８株乳酸菌在人工胃液中培养发现，其中7株乳酸菌死亡率较高，仅有1株菌株能够耐受，活菌数的数量级为1×106CFU/mL。许多细菌都表现出自动聚集的特性，在自聚集中，相同类型的细菌会形成多细胞团块，最终沉淀在培养管的底部［28］。在肠道中，自聚集力是评估细菌能否在肠壁定殖能力的关键［15］。Ahire等［15］对乳酸菌UBLP40研究发现，乳酸菌UBLP40自聚集力为9.66±0.26，显著高于其他对照组，可促进乳酸菌UBLP40在肠道的定殖。

通常乳酸菌的主要抑菌成分包括有机酸、过氧化氢、细菌素等［29］。

植物来源的植酸酶最适pH值范围较窄，在单胃禽畜的胃肠环境中很难发挥作用［30］；微生物来源的植酸酶凭借高活性、稳定性良好、适用范围广、分离纯化简便等特性而广泛应用。曹伟超等［31］筛选出一株乳酸菌L-19，胞外酶活为1.36 U/mL，可降低黑豆酸面团中的植酸含量。研究以微生物产植酸酶为主，从发酵饲料、浆水、博扎中分离得到4株产植酸酶乳酸菌菌株，径16SrDNA分子鉴定，1株为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），1株为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），1株为发酵乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum），1株为斯特拉斯堡乳植物杆菌 （Lactiplantibacillus argentoratensis），其中植物乳杆菌JS5胞外植酸酶酶活达到0.83 U/mL。麦日艳古·亚生等［32］从发酵乳制品中筛选出41 株乳酸菌，发现41株菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有抑制作用，研究分离的4株乳酸菌抑菌谱更广。Heo等［33］从健康仔猪粪便中分离得到植物乳杆菌JDFM LP11，具有较强的胃肠道耐受性。吴雨甍等［34］从酱香型白酒酒醅中分离出6株乳酸菌，菌株可耐受pH值 3.0和0.5%胆盐，在模拟人体胃液、肠液中处理3 h后，其活菌数均＞106 CFU/mL。研究4株乳酸菌具有较强的胃肠道耐受性，表明菌株具备在肠道定殖的基本能力，可以以活菌的形式定殖在肠道中。肠上皮细胞是益生菌发挥免疫调节作用的重要位点，益生菌对肠上皮细胞的黏附能力是其发挥益生功能的基础［35］，4株乳酸菌株的高自聚集力可促进在肠道的定殖。乳酸菌株JS5具有较高的植酸酶活力和益生能力，具有作为饲用益生菌的潜在能力。

4结 论

筛选出4株产植酸酶乳酸菌，其中菌株JS5植酸酶酶活高达0.83 U/mL，与植物乳杆菌菌株 DSM 20174的相似性为100%，该菌株为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）。菌株JS5发酵液对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌均有抑制作用。植物乳杆菌JS5产植酸酶较高，可在模拟肠胃液中存活，具有良好的细胞黏附能力和抑制病原菌生长，可用于益生的畜禽微生态制剂。从发酵饲料、浆水、博扎中分离筛选得到的乳酸菌JS5、JS2、S1、J6对酸、胆盐、肠胃液有一定的耐受性，具有良好的细胞黏附能力，能够抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌的生长，综合性能菌株JS5可作为饲用益生菌。

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Screening of phytase producing probiotic lactic acid bacteria

WANG Haozhong1，2， LIN Qing2， ZENG Jun2， GAO Yan2， ZHAO Yanhui3， SHI Hongling2， MA Guijun3， MA Zhenghai1， LOU Kai2， HUO Xiangdong2

（1.College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi 830046， China; 2. Xinjiang Laboratory of Special Environmental Microbiology / Institute of Microbiology， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China; 3.Xinjiang Tiankang Feed Co.， Ltd， Wujiaqiu Xinjiang 750300， China）

Abstract：【Objective】 To isolate and characterization phytase production probiotic lactic acid bacteria.

【Methods】 Morphologically different strains were isolated from fermented feed， boza and Jiangshui. Through enzyme production screening and 16S rDNA molecular identification， phytase producing lactic acid bacteria strains were obtained and evaluated through acid tolerance， bile salt tolerance， intestinal and gastric juice tolerance， self-aggregation ability， and antibacterial analysis.

【Results】 Four phytase producing lactic acid bacteria were identified. Among them， strain JS5， which was 100% similar to Lactobacillus paracasei JCM 1171， with a maximum phytase activity of 0.83 U/mL. The strain was designated as lactobacillus paracasei. The survival rate of strain JS5 under pH 3 was as high as 100%. At a bile salt concentration of 0.1%， the survival rate of JS5 was 0.55%. In simulated gastric juice and intestinal juice， the survival rates were 8.56% and 0.38%，respectively， and the number of viable bacteria was above 1×106CFU/mL， which was the lowest viable bacteria number with beneficial effects. The self-aggregation ability of strain JS5 was （9.69±0.44）， which can promote the colonization of strain JS5 in the intestine. It had inhibitory effects on Escherichia coli， Salmonella， Staphylococcus aureus， Candida albicans， and Pseudomonas aeruginosa.

【Conclusion】 Lactobacillus paracasei JS5 has a high phytase production and can survive in simulated gastrointestinal fluid. It has good cell adhesion ability and inhibits the growth of pathogenic bacteria and can be used as a probiotics for livestock and poultry.

Key words：lactic acid bacteria; phytase; screen

Fund projects：Key R amp; D Program of Xinjiang Production and Construction Corps （2022AB013）; Project for Stable Support to Agricultural Sci-Tech Renovation（xjnkywdzc-2023005-6）

Correspondence author：LOU Kai（1968-）， male， from Henan， professor， research direction： microbiology， （E-mail）loukai02@mail.tsinghua.edu.cn

HUO Xiangdong（1977-）， male， from Gansu， associate professor， research direction： microbial resources， （E-mail）xiangdonghuo@163.com

收稿日期（Received）：2024-02-14

基金项目：新疆生产建设兵团重点研发计划专项（2022AB013）；农业科技创新稳定支持项目（xjnkywdzc-2023005-6）

作者简介：王浩中（1997-），男，甘肃人，硕士研究生，研究方向为微生物学，（E-mail）490335311@ qq.com

通讯作者：娄恺（1968-），男，河南人，研究员，博士，研究方向为微生物学，（E-mail）loukai02@mail.tsinghua.edu.cn

霍向东（1974-），男，甘肃人，副研究员，博士，研究方向为微生物资源，（E-mail）xiangdonghuo@163.com