不同保藏条件对草菇菌丝生长的影响

2024-12-26吴振强

东南园艺 2024年6期

摘要要：【目的】为探索适宜草菇生产的菌株保藏10个月的环境条件，保证现有草菇菌株的优良特性。【方法】以‘V9715’草菇为供试菌株，设置保藏温度、保藏基质、添加剂等3个保藏条件因素，从菌丝的萌发与生长、厚垣孢子数量及酶活力等方面分析评价保藏效果，探索不同保藏因素对草菇菌株保藏10个月保藏效果的影响。【结果】在不同保藏条件下保藏10个月，草菇菌丝的萌发和生长情况、厚垣孢子形成早晚、酶活力均存在差异。其中以保藏条件处理C（20℃+玉米芯+液体石蜡）的菌丝萌发率88.30%为最高，萌发天数为2 d，厚垣孢子形成时间是11.5 d，满皿天数4 d为最短，菌丝生长速度1.14 cm/d为最快，其菌丝长势强、气生菌丝浓密度大、菌丝生物量中等；而保藏条件处理A（8℃+棉籽壳+无添加剂）的菌丝生物量最多（0.36 g），但与其他处理差异不显著。处理C（20℃+玉米芯+液体石蜡）的菌丝细胞色素 P450 氧化还原酶（CPR）、多酚氧化酶（PPO）活力最低，分别为2.16 mg/g FW、36.91 U/g FW，总淀粉酶（AMY）活力最高，为11.88 mg/（min·g） FW。【结论】在处理C（20℃+玉米芯+液体石蜡）保藏条件下，保藏草菇菌株10个月的保藏效果最好。

关键词：草菇；保藏条件；温度；基质；添加剂；菌丝；酶活力

中图分类号：S646.13" " " " " " " " " " " 文献标识码：A" " " " " " " " " " " "文章编号：2095-5774（2024）06-0472-09

Influence of Different Preservation Conditions on the Growth of Volvariella volvacea Hyphae

Wu Zhenqiang

（Zhangzhou Institute of Agricultural Sciences，Zhangzhou，Fujian 363005，China）

Abstract：【Objective】To explore the environmental conditions suitable for the preservation of Volvariella volvacea strain for 10 months and ensure the excellent characteristics of the existing V. volvacea strains. 【Method】 Taking V. volvacea‘V9715’as the test strain，three preservation condition factors such as preservation temperature，preservation substrate，and additive were set. The preservation effect was analyzed and evaluated from aspects such as the germination and growth of hyphae，the number of chlamydospores，and enzyme activity to explore the influence of different preservation factors on the preservation effect of V. volvacea strains after 10 months of preservation.【Result】 After 10 months of preservation under different preservation conditions，there were differences in the germination and growth of V. volvacea hyphae，the formation time of chlamydospores，and enzyme activity. Among them，the germination rate of hyphae under preservation condition treatment 3 （20℃ + corncob + liquid paraffin） was the highest at 88.30%，the germination days were 2 days，the formation time of chlamydospores is 11.5 days，and growth days to fill petri dish were the shortest at 4 days. The hyphal growth rate was the fastest at 1.14 cm/d. The hyphae have strong growth potential，high density of aerial hyphae，and medium mycelial biomass while the mycelial biomass was the largest （0.36 g） under preservation condition treatment 1 （8℃ + cottonseed hull + no additive）. There is no significant difference among other treatments. The activities of cytochrome P450 oxidoreductase （CPR） and polyphenol oxidase （PPO） of hyphae under treatment 3 （20℃ + corncob + liquid paraffin） are the lowest，which were 2.16 mg/g FW and 36.91 U/g FW，respectively. The activity of total amylase （AMY） was the highest，which was 11.88 mg/（min·g） FW. 【Conclusion】 Under the preservation condition of treatment 3 （20℃ + corncob + liquid paraffin），the preservation effect of V. volvacea strains for 10 months was the best.

Key words：Volvariella volvacea；Preservation method；Temperature；Substrate；Additive；Mycelium；Enzyme activity

草菇（Volvariella volvacea（Bull.）Singer），又名兰花菇、麻菇、贡菇、中国菇等［1］，分类学上属于担子菌亚门，层菌纲，无隔担子，伞菌目，鹅膏菌科，草菇属［2］。草菇味道鲜美，营养丰富，富含多糖、蛋白质、氨基酸等营养成分，深受消费者喜爱［3］。目前福建漳州的草菇生产种‘V9715’在每年3、4月份从广东微生物研究所购买，长途运输过程中，母种易因温度偏低及温差大、缺氧造成菌株活力降低，或是在运输中试管破裂，感染杂菌，不利于草菇生产者制备和选用优良菌株，每年因菌种质量问题造成的经济损失也不断上升，给草菇产业带来巨大的经济损失，严重制约草菇产业的发展壮大。菌种保藏是保持菌种质量稳定性、防止菌种退化的重要手段［4-5］。菌种保藏方法及效果是种质资源研究的重要方面［6］，但目前草菇菌种保藏技术研究较少，草菇长期液氮保藏［7］，由于成本过高，不能满足草菇菌种的中短期保藏生产需求。目前广泛采用的继代培养法操作简单，但费时、易污染、易退化。由于草菇是典型的高温型食用菌［8］，不耐低温保藏，研究热点集中在低温保护剂的筛选及保藏效果评价，如陈明杰等［9］采用添加10%的甘露醇溶液4℃保藏草菇菌种，保藏的菌种能快速复活且稳定遗传。王永红等［10］采用海藻糖溶液4～6℃保藏草菇菌种可达8个月，赵风云等［11］采用甘露醇提高草菇退化菌种的抗氧化能力及恢复其生产性状。张金霞［12］指出菌落形态特征、气生菌丝、菌丝形态、酯酶同工酶谱、可溶性蛋白带可用于鉴别草菇菌种保藏效果，但厚垣孢子作为草菇保藏效果指标鲜见报道。综上所述，目前关于草菇菌株保藏的研究报道并不多，而且保藏处理方法也不统一，对保藏效果的评价更是单一，对于草菇菌株的保藏温度、保藏基质、添加剂问题，并没有实质性的系统研究。

本研究针对草菇菌株在保藏中难以保持遗传性能稳定的问题，以草菇‘V9715’为供试菌株，探索不同保藏因素对草菇菌株10个月保藏效果的影响，分析保藏温度、保藏基质、添加剂等3个因素对菌丝萌发率、萌发时间、生长速度，气生菌丝浓密度、厚垣孢子数量及酶活力的影响，筛选适宜的保藏条件，保证现有草菇菌株的优良特性，提高草菇的质量和产量，促进菇农的增收，有利于草菇产业健康稳定发展。

1材料与方法

1.1供试菌株

供试的草菇菌株‘V9715’，来源于广东省微生物研究所。

1.2 保藏环境条件初筛

1.2.1基质和添加剂组合筛选

在12℃保藏温度下，配置棉籽壳、茶渣、玉米芯等3种保藏基质和蒸馏水、液体石腊、无添加等不同添加剂的保藏条件处理组合，共9组组合，每种处理组合保藏12支试管。考察草菇保藏处理3个月下菌丝的萌发率、萌发时间和生长速度等指标，筛选合适的保藏条件组合。

1.2.2 不同基质组合的保藏温度筛选试验

对1.2.1初选出的组合分别进行保藏温度（4℃、8℃、12℃、16℃、20℃）梯度试验，每个温度处理保藏12支试管。不同的草菇保藏温度处理3个月，筛选草菇菌丝萌发率高、萌发时间短、长速快的保藏温度。

1.3不同保藏条件试验处理

在1.2保藏环境条件初筛结果基础上设计了不同保藏条件试验处理，设置了处理A、处理B和处理C，并参考文献［13］再设计1个处理，即共有4个草菇保藏，菌株保藏处理均为10个月，每种处理保藏12支试管。

1.3.1 草菇菌株活化处理

保藏10个月结束后，将保藏处理的试管取出，置于32℃培养室中自然回温24 h，并转接活化3次，重复3次。

1.3.2 保藏效果评价

经活化处理的菌株分别接种于PDA平皿培养基中央，每个处理转接3个培养皿，在32℃条件下培养，记录并计算菌丝的萌发率［11，14］、萌发天数、满皿天数、菌丝长势、气生菌丝的浓密度、菌丝生长速度、菌丝生物量、以及厚垣孢子的形成时间和数量，测定菌丝的漆酶（LACC）、纤维素酶（CMC）、总淀粉酶（AMY）、细胞色素P450氧化还原酶（CPR）、碱性蛋白酶（AKP）、多酚氧化酶（PPO）活力等指标。

1.3.3 菌丝生长情况测定

转接后培养一定时间，待菌丝长出后，在培养皿上进行划线标记，3 d后划另一条线。测量3 d气生菌丝生长长度，计算气生菌丝生长速度，测定气生菌丝浓密度、菌丝生物量和厚垣孢子数量，每个保藏处理设3个重复。

气生菌丝生长速度（cm/d）=3 d的气生菌丝生长长度/3 d［15］。

气生菌丝浓密度的测定［8］：每个处理菌丝长满皿后观察菌丝长势强弱、气生菌丝的浓密度，均分为3级，1、2、3级分别表示菌丝浓密度大、中、小。

菌丝生物量测定：待菌丝长满皿后，取3块

1 cm2长满菌丝的菌丝块置于100 mL液体PDA中，32℃培养5 d，过滤去除培养液，用ddH2O将菌丝体冲洗3遍后进行冷冻干燥处理，将冻干后的菌丝称重即为菌丝生物量［16］。

厚垣孢子数量测定：将长满草菇菌丝的培养皿放置半个月再观测厚垣孢子数量，统计方法同气生菌丝浓密度。

1.3.4 菌株酶活测定

保藏10个月后的草菇菌株用平板活化培养

5 d后刮取菌丝，测定LACC、CMC、AMY、CPR、AKP、PPO等酶活力，按照试剂盒（苏州格锐思生物科技有限公司）说明测定。

2 结果与分析

2.1 基质和添加剂组合初筛结果

在12℃保藏温度下保藏3个月，不同基质和添加剂组合保藏草菇菌株，对菌丝萌发和生长的影响如表1所示。供试9种组合处理的菌丝萌发率为58.3%～91.67%，从高到低排序前2的组合为处理9-1（玉米芯+液体石蜡）和处理1-1（棉籽壳），二者萌发率均超过80%，处理2-1、处理3-1、处理5-1的萌发率均为75.00%；处理5-1（茶渣+蒸馏水）的菌丝生长速度最快，为0.99 cm/d；各处理的萌发天数为3.5～4.0 d，差异不大。因此，初筛出萌发率高、萌发时间短、生长速度快的3个组合，分别为玉米芯+液体石蜡、棉籽壳+无添加剂、茶渣+蒸馏水。

2.2 不同基质组合的保藏温度梯度试验结果

棉籽壳+无添加剂组合的温度梯度试验结果如表2所示，萌发率最高的是保藏温度8℃；萌发天数最短的是保藏温度8℃、12℃；菌丝生长速度最快的是保藏温度12℃。

茶渣+蒸馏水组合的温度试验结果如表3所示，萌发率最高的是保藏温度12℃，最低的是4℃；萌发天数最短的是保藏温度12℃；菌丝生长速度最快的是保藏温度12℃。

玉米芯+液体石蜡组合的温度试验结果，如表4所示，萌发率最高的是保藏温度20℃，最低的是4℃；萌发天数最短的是保藏温度16℃、20℃；菌丝生长速度最快的是保藏温度20℃。

因此3种基质+添加剂组合最适保藏温度分别为棉籽壳+无添加剂+8℃、茶渣+蒸馏水+ 12℃、玉米芯+液体石蜡+ 20℃，由此分别设计了草菇菌株保藏10个月环境条件的处理A、处理B、处理C，同时参考文献［13］再设计出处理D，具体见表5。

2.3 不同保藏条件保藏效果评价

2.3.1不同保藏条件对草菇菌丝生长的影响

不同保藏条件保藏10个月再经转接活化后，对草菇菌丝萌发、菌丝长势、满皿天数、厚垣孢子形成时间数量、生长速度等影响如表6所示。不同方法保藏菌株效果有一定差异。4种处理的菌丝萌发率为61.34%～88.30%，萌发天数为2.0～3.5 d，萌发率最高、萌发天数最短的是处理C、处理D；满皿天数为4～8 d，并以处理C的满皿时间最短，与处理D差异不显著，与处理A、处理B差异极显著；菌丝长势强的是处理A、处理B，菌丝长势一般的是处理C、处理D；气生菌丝浓密的是处理A、处理B，气生菌丝稀疏的是处理C、处理D；厚垣孢子形成时间为11.5～13.5 d，形成时间最短的是处理C、处理D，与其它处理差异极显著；菌丝生长速度为0.94～1.14 cm/d，以处理C的生长速度最快，与处理D差异不显著，与其它2个处理的差异显著，但未达到极显著水平；菌丝生物量为0.09～0.36 g，以处理A的菌丝生物量最多，但与其它3个处理的差异不显著。

综上所述，处理C（20℃+玉米芯+液体石蜡）萌发率最高（88.30%）、萌发天数最短（2 d）、菌丝长势强、气生菌丝浓密度大，满皿天数最短（4 d）、厚垣孢子形成时间最短（11.5 d），菌丝生长速度最快（1.14 cm/d）。

2.3.2不同保藏条件对草菇菌株酶活力的影响

不同保藏条件对草菇菌株的漆酶（LACC）、纤维素酶（CMC）、总淀粉酶（AMY）、细胞色素 P450 氧化还原酶（CPR）、碱性蛋白酶（AKP）、多酚氧化酶（PPO）活力有一定的影响（见表7）。4种处理的漆酶（LACC）活力为8.84～

12.81 nmol/（min·g） FW，以处理D最高，与处理A差异不显著，但都显著高于处理B和处理C。纤维素酶（CMC）活力为1 229.08～1 284.01 μg/（min·g）FW，以处理A最高，各处理间均无显著性差异。AMY活力为11.38～11.88 mg/（min·g）FW，以处理

C最高，但与处理B、处理D差异不显著。细胞色素

P450 氧化还原酶（CPR）活力为2.16～3.04 mg/g FW，

以处理A和处理B极显著高于处理C和处理D。碱性蛋白酶（AKP）活力为3.02～12.97 nmol/（min·g）" FW，以处理4最高，与处理B、处理C差异达极显著水平，与处理A差异不显著。多酚氧化酶（PPO）活力为36.91～42.80 U/g FW，以处理A最高，与处理B、处理D差异不显著，但显著高于处理C。

综上所述，处理C表现总淀粉酶（AMY）活力最高，纤维素酶（CMC）、细胞色素P450氧化还原酶（CPR）、多酚氧化酶（PPO）活力最低，总淀粉酶活性可作为菌丝活力的指标［17］，细胞色素P450的CPR、PPO酶活力与草菇菌株的应激反应机制有关［18-19］，说明处理C菌丝活力最强，保藏条件适宜。

3 小结与讨论

本试验通过设置不同保藏条件保藏草菇菌株10个月，发现草菇菌丝萌发情况、生长速度、气生菌丝浓密度、菌丝长势、厚垣孢子形成时间、酶活力等存在差异。处理C（20℃+玉米芯+液体石蜡）表现萌发率最高、萌发天数最短、菌丝长势强、气生菌丝浓密度大，满皿天数最短、厚垣孢子形成时间最短，菌丝生长速度最快，说明处理C的菌丝活力最强，保藏条件适宜。分析原因为处理C的保藏基质为玉米芯，玉米芯富含纤维素、半纤维素等营养成分，且具有良好的透气性和保水性，有利于氧气的供应和水分的保持，为草菇菌丝的生长创造了适宜的环境条件，草菇菌丝健壮、长势好，有利于保藏后菌丝的恢复生长。保藏温度为20℃，草菇菌株不耐低温，低温保藏会导致菌丝死亡，20℃保藏温度较适宜，有利于菌丝活力的保持。保护剂为液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌株死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用，使菌体处于生长和代谢近乎停止的状态，因此可确保保藏菌株的质量和活力。

处理C总淀粉酶（AMY）活力最高，纤维素酶（CMC）、细胞色素P450氧化还原酶、多酚氧化酶活力最低；处理A纤维素酶（CMC）、细胞色素P450氧化还原酶（CPR）、多酚氧化酶（PPO）活力最高，总淀粉酶（AMY）活力最低。分析原因可能是淀粉酶活性与菌丝活力相关［17］，保藏后转接至新的 PDA 培养基后，菌丝为了快速适应新环境并获取能量，会增强淀粉酶的分泌，提高淀粉酶活性来分解培养基中的淀粉，以满足自身的生长和代谢需求。因此处理C的菌丝活力强，总淀粉酶（AMY）活力也最高。纤维素酶（CMC）活力与保藏基质有关，棉籽壳比玉米芯纤维素含量高，转接至新的PDA 培养基中，促使菌丝产生了更多的纤维素酶。因此处理A的纤维素酶（CMC）比处理C高。细胞色素P450 氧化还原酶（CPR）参与多种生物代谢过程［18］，包括菌丝应对外界胁迫。多酚氧化酶（PPO）活力变化影响菌丝的防御能力以及与周围环境的相互作用［19］。当草菇菌株处于不适宜生长的温度条件（如 8℃）时，为了应对这种不利环境，可能会分泌更多的细胞色素P450 氧化还原酶（CPR）、多酚氧化酶（PPO），可能是草菇菌株的一种应激反应机制。因此处理C

的保藏条件较适宜，细胞色素P450 氧化还原酶（CPR）、多酚氧化酶（PPO）最低，相反的，处理A的保藏条件不适宜草菇菌丝生长，因此CPR、PPO酶活最高。

本试验处理C即草菇菌株保藏10个月、保藏基质为玉米芯、保护剂为液体石蜡、保藏温度20℃保藏效果最佳，可进一步扩大数量验证。本试验利用液体石蜡、蒸馏水作为保护剂保藏草菇，液体石蜡作为保护剂，菌丝成活率高，回菌后菌丝生长正常。也有学者指出以甘油与蔗糖溶液［20］、PEG6000［21］、蔗糖、甲醇、丙三醇复合配方［22］、海藻糖［23］等作为保护剂保藏食用菌效果好。不同种类的食用菌菌株需要的保护剂各有差异，在草菇菌株上是否也适用，有待于进一步验证。

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