丰水期长荡湖水质评价与微生物群落结构特征研究

关键词：丰水期；长荡湖；水质评价；微生物群落

中图分类号：X171.4 文献标志码：B

前言

微生物是水生态系统的重要组成部分，在维持水生态系统的功能和健康中起着重要作用，同时微生物也是反映水环境健康的重要指标。张建波等认为后生浮游动物可作为湖泊水环境变化的指示性生物。由于微生物能将对生态环境造成威胁的有机物和有毒物质转化为可以维护生态平衡的无机物。如枯草芽孢杆菌是一类革兰氏阳性菌，其分泌的多种高活性胞外酶，能快速分解并吸收水环境中的有机物，以达到改善水质的效果。因此全面调查长荡湖微生物群落组成是极有必要的。

长荡湖位于江苏省常州市。长荡湖南北长约15.5km，东西宽约9km，湖泊总面积85.31km²，平均水深1.1m。随着长荡湖周边农业、渔业的快速发展以及过度城镇化，导致湖泊水体严重富营养化，水质日渐恶化。

目前有关长荡湖的研究主要聚焦于藻类、动物的群落结构特征以及沉积物污染风险等方面，但鲜有全面研究长荡湖微生物群落结构组成。鉴于丰水期雨量充沛，水样采集方便且丰水期长荡湖的水体污染更为严重。因此此研究基于2021年6月长荡湖采样数据，采用2种水质评价方法综合评价丰水期长荡湖水质现状，并运用高通量测序技术分析长荡湖微生物群落结构特征，为控制长荡湖水体污染和生态修复提供理论依据。

1材料与方法

1.1采样点设置与采样时间

根据长荡湖地形轮廓，在长荡湖南部、中部、东部和北部共设置4个采样点。4个采样点编号依次为W156、W158、W160、W163，于2021年6月（丰水期）进行水体样品采集。采样点的分布见图1。

1.2水样采集与测定方法

使用有机玻璃采水器采集长荡湖表层水，每个采样点采集1L水样，保存于已消毒灭菌并用样本底水充分清洗的聚乙烯取样瓶中，并在4℃条件下运回实验室。其中500 mL水样用于理化因子测定，500 mL在实验室无菌环境下使用0.45μm滤膜过滤后，将滤膜放入10mL冻存管并保存于-80℃冰箱，用于后续DNA测序。

此次测定理化指标包括总有机碳（TOC）、总氮（TN）、总磷（TP）、水温（WT）、pH值及溶解氧（DO）。TOC采用燃烧氧化-非分散红外吸收法；TN采用碱性过硫酸钾-紫外分光光度法；TP采用钼酸铵分光光度法；采用YSI多参数水质分析仪（YSI PR01020，USA）现场测定WT、pH和DO。

1.3微生物群落测序分析方法

先在无菌环境中将滤膜剪成碎片，然后使用PowerWater DNA（MOBIO，USA）试剂盒提取基因组DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA。使用正向引物341F（5’-CCTAYGGGRBG-CASCAG -3’）和反向引物806R（5’-GGACTAC-NNGGGTATCTAAT-3’）对V3-V4可变区进行PCR扩增。使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosci-ences，Union City，CA，USA）进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。测序采用IlluminaMiSeq PE300高通量测序平台进行测序。PCR及测序均由上海凌恩生物科技公司完成。

1.4数据处理与分析

水质评价方法分别采用水污染指标法和内梅罗指数法2种评价方法。

1.4.1水污染指数法

水污染指数法以单因子指数法为基础，内插计算出各污染指标的WPI值，选取WPI值的最高值来判定水体污染等级。选取的环境参数为总氮、总磷、DO，每个参数的WPI值计算公式如式（1）：

基于Microsoft Excel处理的原始实验数据；微生物多样性指数使用QIIME软件（1.7.0版）计算，使用Origin 2018软件绘制物种丰度柱状图。依托微信在线平台绘制Circos图分析各片区门分类水平下微生物群落结构特征。

2结果与讨论

2.1长荡湖水质现状

长荡湖理化因子浓度与空间分布有一定关联。如表1所示，长荡湖3个理化因子呈现从南到北浓度逐步降低的趋势。其中TN浓度从1.14 mg/L降至0.68 mg/L；TP浓度从0.1 mg/L降至0.03 mg/L；TOC含量从5.4 mg/L降至3.8 mg/L。这是因为丰水期降雨量大，且人湖河流在长荡湖北部的输水量更多，因此造成了长荡湖南部污染物浓度高于北部。长荡湖各片区的WT、pH差距不大，长荡湖南部片区和北部片区DO浓度低于中部和东部片区。整体而言，除南部片区，长荡湖其他片区的理化指标均达到地表Ⅲ类水标准。

运用水污染指数法、内梅罗指数法分别对丰水期长荡湖进行水质评价。2种水质评价方法结果显示：长荡湖南部片区比其他3个片区水质现状严重，超标因子为TN、TP。但采用水污染指数法评价的水质现状普遍低于内梅罗指数法。因为水污染指数法是基于单因子指数法，即采用“最差规则”来确定水质等级，虽然对单项指标有较好的评价意义，但缺乏对水体环境综合考虑。总体而言，长荡湖南部片区的部分水质指标（TN、TP）超标，但长荡湖整体水质达标。

2.2长荡湖微生物群落分布特征

2.2.1微生物群落Alpha多样性指数分析

长荡湖微生物群落Alpha多样性指数分析结果见表2。

长荡湖4个采样点的Coverage指数均在97%以上，说明此次测序结果可靠。Ace、Chaol指数代表微生物丰富度。北部片区Ace指数最高，达5 462；中部片区最低，为2 590。相同地，北部片区Chaol指数最高（5248），而中部片区最低（2528）。Shannon、Simpson指数表示微生物群落的多样性。Shannon指数最高的是北部片区，其次为东部片区、南部片区、中部片区。Simpson指数与Shannon指数反映结论一致。总体而言，长荡湖微生物群落的丰富度与多样性呈现出北部片区gt;东部片区gt;南部片区gt;中部片区的规律。

2.2.2门分类水平微生物群落结构

长荡湖微生物群落在门分类水平上具有较高的多样性。4个采样点中共检测出32种已知微生物菌门，长荡湖微生物在门分类水平上组成如图2（a）所示，其中相对丰度排在10名之后的菌门和其他未知物种归为其它（ others）。长荡湖相对丰度大于10_10的主要菌门有放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteriota）。

不同片区优势菌门的种类相似。如放线菌门（Actinobacteria）为长荡湖各片区占比最高的优势菌门，据报道放线菌门（ Actinobacteria）是湿地、湖泊及海洋等各种水环境细菌群落中的优势门类。相比其他细菌，放线菌能更好地躲避原生动物的捕食，死亡率相对较低；在氮、磷等营养物质元素充足的湖泊中，碳源常会限制细菌生长繁殖，而放线菌在利用碳源方面具有更强的竞争力，所以水中放线菌门（Actinobacteria）的占比相对较高。但不同片区优势菌门的相对丰度却有所差别。蓝细菌门（Cyanobac-teria）在长荡湖北部片区和东部片区的相对丰度分别为13.27%和5.86%，高于长荡湖中部片区（2.93%）和南部片区（0.81%）。研究表明蓝细菌门（Cyanobacteria）繁殖过多则会引发水华、使水体富营养化且蓝藻生长潜力由营养物质浓度决定。但此研究中北部、东部片区的氮磷浓度低于南部和中部片区，猜测是人湖河流含有大量的蓝细菌，进而导致北部、东部片区蓝细菌门（Cyanobacteria）的丰度急剧上升。长荡湖南部片区和中部片区厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度为16.86%、20.92%，远高于东部（0.25%）和北部片区（0.35%）。这与李建松等研究结论一致。研究发现厚壁菌门（Firmi-cutes）是蓝藻水华降解末期的最优势菌门。原因可能是蓝藻降解末期水体中溶解氧几乎耗尽，引起了嗜阳菌属（Heliophilum）的大量增殖，进而导致厚壁菌门（Firmicutes）在水体中的比例上升。

Circos图可以直观展现长荡湖不同片区的门分类水平微生物群落组成情况。如图2（b）所示，放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）在不同片区生物量分布均匀。如放线菌门（Actinobac-teria）是长荡湖各片区占比最高的菌门，其在南部片区、中部片区、东部片区及北部片区的相对丰度依次为36.6%、43.01%、39.56%、33.85%。疣微菌门（Verrucomicrobia）、蓝细菌门（Cyanobacteria）相对丰度呈现由南到北逐渐递增的趋势。而厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度呈现由南到北逐渐递减的趋势。特别是拟杆菌门（Bacteroidetes）在北部片区（13.72%）、南部片区（11.52%）、东部片区（11.85%）的相对丰度相近，但高于中部片区（3.94%）。由于人湖河流携带的污染物对长荡湖水质有一定影响，猜测长荡湖北部、南部和东部片区的拟杆菌门相对丰度的提升来源于人湖河流的输入。可见长荡湖微生物群落结构与空间位置、外源输入有关。

2.2.3科分类水平微生物群落结构

丰水期长荡湖共检测出378种微生物菌科，如图3所示，相对丰度前5的菌科依次为：萤光杆菌科（Ilumatobacteraceae）、鱼孢菌科（Sporichthyaceae）、动球菌科（Planococcaceae）、丛毛单胞菌科（Co-mamonadaceae）。莫拉菌科（Moraxellaceae）。

不同片区的科分类水平下微生物相对丰度有一定差别。如动球菌科（Planococcaceae）在长荡湖南部片区和中部片区的相对丰度远高于东部和北部片区，据报道动球菌科（Planococcaceae）的生长受多种环境因素共同影响，如pH、盐度等。推测可能是人湖河流的输入导致东部和北部片区水体理化性质发生变化，从而造成动球菌科（Planococcaceae）含量降低。长荡湖南部片区和中部片区莫拉菌科（Moraxellaceae）的含量同样高于东部和北部片区。说明科分类水平下微生物与外源输入有关。

2.2.4属分类水平微生物群落结构

长荡湖4个采样点共检测出467种微生物菌属；但所有采样点均有未能确定分类学地位的菌属。如图4所示，相对丰度排在10名之后的菌属和其他未知物种归为其它（others）。长荡湖相对丰度前5的菌属依次为：CL500-29 marine group、hgcl clade、类芽孢八叠球菌属（Paenisporosarcina）、不动杆菌属（Acinetobacter）、Clade Ill_norank。

长荡湖不同片区优势菌属种类相似，但占比不同。CL500-29 marine group是长荡湖占比最高的菌属，其在中部片区的占比高于其他片区。hgclclade分布情况与CL500-29 marine group一致。类芽孢八叠球菌属（Paenisporosarcina）、不动杆菌属（Acinetobacter）的相对丰度呈现出南部片区、中部片区高于东部片区和北部片区。研究表明不动杆菌属（ Acinetobacter）属于变形菌门，是一类重要的反硝化聚磷菌，其生长繁殖受营养物质影响；由于长荡湖氮磷浓度自南到北逐步降低，因此不动杆菌属（Acinetobacter）的相对丰度也是自南到北逐渐下降。相反地，Clade Ill_norank在东部片区、北部片区的相对丰度略高于南部片区与中部片区。可能是入湖河流输入造成的。

3结论

两种水质评价方法结果显示，丰水期长荡湖南部片区污染最为严重，其中超标因子为TN、TP，但整体上长荡湖水质达标。高通量测序结果表明，长荡湖4个采样点共检测出微生物群落32门378科467属。长荡湖各片区的微生物群落中优势菌门、菌科、菌属种类相似，但相对丰度却有所差别。相对丰度前3的优势菌门、菌科分别为放线菌门（Actinobacte-ria）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmi-cutes）与萤光杆菌科（Ilumatobacteraceae）、鱼孢菌科（Sporichthyaceae）、动球菌科（Planococcaceae）；占比前3的优势菌属包含CL500-29 marine group、hgclclade、类芽孢八叠球菌属（Paenisporosarcina）。微生物群落Alpha多样性分析结果显示，长荡湖微生物群落多样性和丰富度呈现北部片区gt;东部片区gt;南部片区gt;中部片区的规律。长荡湖微生物群落结构与空间位置、外源输入有关。