UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS联合网络药理学分析清肺汤抗肺炎活性作用机制

〔摘要〕 目的 采用UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS和网络药理学探讨清肺汤抗肺炎的作用机制。方法 通过UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS法进行分析，鉴定清肺汤的主要化学成分，结合Swisstarget收集清肺汤主要化学成分的作用靶点;利用OMIM、DrugBank及GeneCards等数据库获取“肺炎”的相关靶点，并与清肺汤化学成分靶点取交集筛选出共同靶点，通过蛋白质相互作用网络构建及GO、WikiPathways通路富集分析确定清肺汤治疗肺炎的重要信号通路。结果 通过UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS从清肺汤中鉴别出142种活性成分，获得200个清肺汤成分与肺炎交集靶点，构建网络后获取了44个潜在有效成分和131个肺炎关键靶点。KEGG通路富集分析表明，清肺汤通过MAPK3信号通路、EGFR信号通路、LCK信号通路等多种信号通路以及白细胞介素-5（interleukin-5， IL-5）、白细胞介素-2（interleukin-2， IL-2）和胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin， TSLP）等多靶点发挥抗肺炎的作用。结论 清肺汤中的活性成分可通过多通路、多靶点发挥调节免疫、抗炎、调节细胞凋亡、抗病毒感染和改善肺纤维化的作用，从而起到治疗肺炎的作用。

〔关键词〕 UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS;清肺汤;肺炎;网络药理学;作用机制

〔中图分类号〕R284.1" " " " "〔文献标志码〕A" " " " " 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.12.019

Analysis of the mechanism of action of Qingfei Decoction's"anti-pneumonia activity by UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS"combined with network pharmacology

WANG Junshuai1，2， WANG Xueyi1，2， WANG Xueying1，2， LIU Zhenyin1，2， ZHAO Zhenxia2，"LIU Yongli2*， LI Hui2*

1. School of Pharmacy， Henan University， Kaifeng， Henan 475000， China; 2. Hebei Institute for Drug and Medical Device Inspection， Shijiazhuang， Hebei 050227， China

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of action of Qingfei Decoction's anti-pneumonia activity using UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS and network pharmacology. Methods The major chemical components of Qingfei Decoction were analyzed and identified by UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS. Targets of the identified components were collected using Swisstarget; pneumonia-related targets were retrieved from OMIM， DrugBank， and GeneCards databases. Common targets between the identified components of Qingfei Decoction and pneumonia were screened by taking their intersection. Protein-protein interaction （PPI） network construction and GO/WikiPathways enrichment analyses were performed to identify key signaling pathways involved in Qingfei Decoction's treatment of pneumonia. Results A total of 142 active ingredients were identified from Qingfei Decoction by UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS， yielding 200 intersecting targets between the ingredients and pneumonia. Network construction identified 44 potential effective components and 131 key pneumonia-related targets. KEGG pathway enrichment analysis indicated that Qingfei Decoction exerted its anti-pneumonia effects through multiple signaling pathways， including the MAPK3 signaling pathway， EGFR signaling pathway， and LCK signaling pathway， as well as multiple targets such as interleukin-5 （IL-5）， interleukin-2 （IL-2）， and thymic stromal lymphopoietin （TSLP）. Conclusion The active ingredients in Qingfei Decoction can exert therapeutic effects against pneumonia via multi-pathway and multi-target mechanisms， including immune regulation， anti-inflammatory action， modulation of apoptosis， antiviral effects， and mitigation of pulmonary fibrosis.

〔Keywords〕 UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS; Qingfei Decoction; pneumonia; network pharmacology; mechanism of action

肺炎是指由病毒、细菌、化学污染物等因素引起的疾病，涉及肺泡、肺间质及肺叶部位的炎性病变，在老年与幼儿人群高发，末期可引发败血症及呼吸衰竭[1]。临床肺炎的治疗包括抗感染治疗、对症治疗、支持治疗及并发症治疗[2-3]。抗感染治疗是肺炎治疗的主要环节之一，治疗的药物主要包括抗生素、抗病毒药物和抗真菌药物等，但该类药物在临床应用中易产生耐药性和不良反应[4-5]。因此，从中药中寻找治疗肺炎新药意义重大。

清肺汤出自《万病回春·咳嗽门》，是明朝龚廷贤用于治疗咳嗽的经典名方。清肺汤为《古代经典名方目录（第一批）》收载的汤剂之一，其由黄芩、桔梗、茯苓、橘红和贝母等15味中药组成，原文记载“清肺汤治一切咳嗽，上焦痰盛”[6]。总结古籍及文献中关于清肺汤功效主治的记载，其功效为清肺化痰止咳，临床常用于治疗支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、肺结核、慢性咽炎、支气管喘息、心脏性喘息等病症[7-8]。现代药理作用研究表明，清肺汤可有效改善肺炎患者的血液生化、病理影像学指标，具有依从性好、用药周期短、副作用小等优点[9-10]。但其治疗肺炎的药效物质基础和作用机制尚不明确，因此，对其药效物质基础和作用机制进行阐释有利于指导其临床用药。

中药复方起效机制研究的复杂性主要体现在成分组成、生物学效应两个方面，而网络药理研究模式可以有序地将药物化学、药理学、生物信息学等学科与系统网络分析相结合，从基因分布、分子功能和信号通路等角度解释中药复方如何通过多组分影响多通路、多靶点发挥作用，该研究模式特别适合中药复方作用机制的阐释[11]。本研究通过UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS对清肺汤中化学成分进行鉴定，采用网络药理学技术探寻清肺汤治疗肺炎的主要有效成分和作用机制，以期在分子层面上阐释清肺汤多成分、多途径和多靶点发挥抗肺炎作用的科学内涵，为其治疗肺炎的临床应用提供参考，同时为其深入的作用机制研究奠定基础。

1 材料与仪器

1.1" 试药与试剂

当归（批号：DGYP-2，产地：甘肃岷县）2.61 g、栀子（批号：ZZYP-10，产地：福建福鼎）2.61 g、桔梗（批号：JGYP-3，产地：河北安国）3.73 g、黄芩（批号：HQYP-6，产地：内蒙古赤峰）5.60 g、麦冬（批号：MDYP-5，产地：四川三台县）2.61 g、甘草（批号：GCYP-6，产地：新疆库尔勒博湖县）1.12 g、苦杏仁（批号：KXRYP-7，产地：河北怀来）2.61 g、五味子（批号：WWZYP-11，产地：辽宁新宾）1 g、茯苓（批号：FLYP-11，产地：安徽岳西）3.73 g、橘红（批号：JHYP-5，产地：湖南常德）3.73 g、浙贝母（批号：ZBMYP-11，产地：浙江宁波）3.73 g、桑白皮（批号：SBPYP-13，产地：重庆石柱）3.73 g、天冬（批号：TDYP-12，产地：重庆石柱）2.61 g、生姜（批号：SJYP-02，产地：云南文安县）2 g、大枣（批号：DZYP-06，产地：新疆若羌县）6 g，所用饮片经北京中医药大学任广喜讲师鉴定为正品，且经检验均符合《中华人民共和国药典》（2020年版）质量标准相关要求。水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）;乙腈（质谱级，德国Merck公司）;甲酸（质谱级，美国Sigma公司）。

1.2" 仪器

Vanquish Horizon型超高效液相色谱仪、UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS质谱仪（美国Thermo Scientific公司）;BT25S型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）;JM-B10002型电子天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司）;KQ2200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;LC-10N-50A型台式真空冷冻干燥机（上海力辰仪器科技有限公司）;Milli-Q型超纯水净化系统（美国Millipore公司）。

2 方法

2.1" 清肺汤物质基准冻干粉的制备

处方各药饮片粉碎为过4目筛不过10目筛的粗颗粒，10倍水浸泡30 min，先用1 200 W武火煮沸，后转600 W火继续煎煮45 min，趁热以200目滤除药渣，收集滤液，真空冷冻干燥（Tlt;-40 ℃，Vaclt;20 Pa）60 h。

2.2" 基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的清肺汤化学成分鉴定研究

2.2.1" 色谱条件" 色谱柱为Waters Acquity BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）;流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）;梯度洗脱（0～5 min，5%→7%B;5～15 min，7%→15%B;15～25 min，15% →18%B;25～45 min，18%→20%B;45～55 min，20%→25%B;55～65 min，25%→75%B;65～70 min，75% →95%B）;流速为0.3 mL·min-1;柱温为35 ℃;进样量为5 μL。

2.2.2" 质谱条件" HESI采用正、负离子扫描模式，喷雾电压为3.5 kV;毛细管温度为320 ℃，辅助气温度为400 ℃;扫描范围为m/z 100～1 000;Full MS、dd-MS2分辨率分别为7×104、1.75×104;S-lens RF level为55;辅助气流速为10 arb，鞘气流速为35 arb;NCE为30、35、40。

2.2.3" 供试品溶液制备" 精密称取清肺汤物质基准冻干粉0.2 g，精密加入25 mL 75%甲醇，密塞，称定重量，超声处理20 min（250 W，40 kHz），75%甲醇补足失重量，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2.4" 数据采集与分析" 首先将供试品溶液按照“2.1.1”项下的条件进行质谱分析，利用PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、人类代谢组数据库（human metabolome database，HMDB）和MassBank数据库（https：//massbank.eu/）收集关于清肺汤的相关内容，构建清肺汤成分自建库，根据分子量、碎片离子、不同种类化合物的化学键断裂规律及相关文献资料，并通过与标准品进行比对来对化合物的结构进行解析。

2.3" 基于网络药理学的清肺汤治疗肺炎作用机制研究

2.3.1" 清肺汤中主要活性成分和靶标蛋白筛选" 根据UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的鉴定结果，设定口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%且类药性（drug likeness， DL）≥0.18为筛选条件，建立清肺汤的主要有效成分数据库并得到相关作用靶点信息。

2.3.2" 肺炎靶点的收集和清肺汤抗肺炎的潜在作用靶点预测" 通过Swiss target（http：//www.swisstargetprediction.ch/）对“2.2.1”中清肺汤化学成分组的作用靶点进行预测，规范名称、去除重复项，得到清肺汤活性成分的作用靶点组。进一步在OMIM（https：//www.omim.org/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/，relevance scoregt;1）和PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/）数据库，以“pneumonia”作为关键词进行检索、规范名称并去除重复项，得到肺炎相关的作用靶点，并与预测得到的清肺汤活性成分的作用靶点组取交集并绘制韦恩图，以得到清肺汤治疗肺炎的潜在作用靶点。

2.3.3" 蛋白质-蛋白质相互作用网络和“化学成分-作用靶点”网络的构建" 将“2.2.2”中得到的清肺汤治疗肺炎的潜在作用靶点导入STRING 11.5（https：//cn.string-db.org），限定物种为“Homo sapiens”，将筛选后的结果保存为“TSV”格式，导入Cytoscape 3.7.1软件（https：//www.cytoscape.org/）对其进行可视化，以“String Physical Scoregt;0.132，Network Sizegt;3”为条件，使用Cytoscape的MCODE功能对蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction， PPI）网络进行分析。并利用Cytoscape软件完成“化合物-作用靶点”网络的构建。

2.3.4" 基因本体富集分析" 通过DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）和WikiPathways数据库（https：//www.wikipathways.org/index.php/WikiPathways）对得到的交集靶点进行GO富集分析，输入潜在作用靶点并限制物种为人，得到的分析结果以Plt;0.05为指标进行筛选。使用R语言对结果进行可视化处理，分析得到清肺汤治疗肺炎的作用机制。

3 结果

3.1" 基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的清肺汤化学成分分析

清肺汤正、负离子扫描模式的总离子流图见图1，将质谱数据导入Xcalibur 4.1中的Qual Browser程序，调取MS离子并模拟分子式，结合MS2碎片离子、数据库（Massbank of North America、MassBank Europe）及文献共鉴定出142个化合物，其中黄酮及其苷类成分占比较大。其中92个化合物可明确其归属，其详细信息见表1。

3.2" 基于网络药理学的清肺汤治疗肺炎作用机制研究

3.2.1" 清肺汤中活性成分和靶标蛋白筛选" 符合条件OB≥30%，DL≥0.18的化合物共有44个，其中甘草中活性成分12种，黄芩中活性成分9种，且筛选得到的活性成分多属于黄酮类成分及其衍生物，通过PubChem数据库获取活性成分的sdf格式分子结构，通过SwissTargetPrediction平台预测得到对应靶标550个。

3.2.2" 肺炎疾病靶点和清肺汤治疗肺炎潜在靶点" 利用OMIM、DrugBank、GeneCards和PharmGKB数据库检索得到肺炎相关靶点1 508个，通过Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）平台将清肺汤主要化学成分所对应的靶点与肺炎疾病靶点取交集，得到200个清肺汤治疗肺炎的潜在靶点，详见图2。

3.2.3" “化学成分-作用靶点”交互网络的构建与分析" 利用Cytoscape 3.7.1软件构建的化学成分-靶点交互网络见图3。通过分析筛选到的关键化合物有44个，关键靶点有131个。其中排名前10位的化合物是6-姜酚、五味子醇甲、五味子酯乙、10-姜酚、槲皮素、汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷、5，7，8-三羟基黄酮、甘草苷;排名前5的靶点是IL-5、EGFR、LCK、TNF、MAPK3，见表2和表3。由图3可知，1个活性化合物可对多个靶点起作用，与此同时也存在多个成分对1个靶点起作用，体现了清肺汤多成分和多靶点相互协同治疗肺炎的特点。

3.2.4" 清肺汤治疗肺炎潜在靶点PPI网络构建" 利用Metascape平台构建PPI网络，经平台MCODE算法分析得5个节点数大于3的显著聚类簇，见图4。由图4可知，包含130个节点和104 1条边。靶蛋白的平均节点等级值为30，超过平均节点等级值的有50个。筛选出前5个节点度值的靶点蛋白，分别是IL-2、MAPK14、NFKB1、PIK3R1、NTRK1，揭示其可能是清肺汤治疗肺炎的主要作用靶点。

3.2.5" GO富集分析" 通过DAVID网站中的GO富集分析得到了GO条目（Plt;0.05），其中包含465个生物过程（biological process， BP）条目，143个分子功能（molecular function， MF）条目和98个细胞组分（cell composition， CC）条目，对各聚类簇的代表条目（-log10

P值降序排名前3者）进行展示，结果如图5所示。在BP中靶点主要涉及正向调节外部刺激反应（positive regulation of response to external stimulus）、酶联受体蛋白信号通路（enzyme linked receptor protein signaling pathway）、炎症反应（inflammatory response）、趋化性（chemotaxis）及细胞因子介导的信号通路（cytokine-mediated signaling pathway）等。在MF中靶点主要涉及磷酸酶结合（phosphatase binding）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）、丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、C-C趋化因子受体活性（C-C chemokine receptor activity）及C-C趋化因子结合（C-C chemokine binding）等。在CC中靶点主要涉及分泌颗粒腔（secretory granule lumen）、细胞质囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）、囊泡腔（vesicle lumen）、膜面（side of membrane）及质膜外侧（external side of plasma membrane）等。

3.2.6" WikiPathways通路富集" 经WikiPathways富集分析后，对各聚类簇的代表条目（-log10P值降序排名前3者）进行展示，结果如图6所示，主要包括白细胞介素-5（interleukin-5， IL-5）信号通路、白细胞介素-2（interleukin-2， IL-2）信号通路、胸腺基质淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin， TSLP）信号通路及抑瘤素M（oncostain M， OSM）信号通路，这些信号通络可能是清肺汤治疗肺炎的主要作用靶点。

4 讨论

清肺汤由黄芩、桔梗和茯苓等共15味药材组成，方中黄芩配伍栀子使二者清肺热、解热毒的作用增强;苦杏仁与天门冬和麦冬配伍，增强止咳平喘作用的同时又强化润肺的作用，缓解肺部燥热;桔梗配伍甘草，使止咳化痰作用增强;贝母配伍苦杏仁和甘草，增强化痰止咳、润肺平喘的作用，贝母配伍黄芩，增强黄芩清热解毒和贝母润肺止咳的作用，贝母与桔梗配伍，起到宣肺平喘、化痰止咳的作用;茯苓与当归配伍，起到调血益气、活血化瘀的作用，茯苓与甘草配伍，起到益气健脾、祛痰湿的作用;桑白皮与黄芩配伍，增强黄芩清热凉血解毒的作用;橘红与甘草配伍，使和中化湿、行气止痛的作用增强，橘红配伍生姜，使二者化痰止咳的作用增强，全方共奏养阴清肺、宣肺止咳、燥湿化痰功效[37-38]。

本研究首先使用UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS技术获取清肺汤的成分信息，初步鉴别142个结构，包括黄酮及其苷类74个、氨基酸类12个、小分子有机酸类12个、木脂素类7个、生物碱类6个、三萜类5个、环烯醚萜类5个、苯酞类4个、香豆素类3个、核苷类3个、姜酚类2个、酯类2个、醛类2个、苯乙醇苷类1个、二苯乙烯苷类1个、氢苷类1个、甾体皂苷类1个、多酚类1个，较为全面地反映了复方的成分信息，其潜在活性成分包括五味子醇甲、黄芩素、槲皮素、6-姜酚及汉黄芩素等。黄芩素可明显缓解炎症和降低炎性因子水平，减轻肺组织水肿和病理损伤，显著降低肺炎球菌性肺炎小鼠死亡率，其主要通过下调肺组织中NF-κB和p38 MAPK在mRNA水平的表达，以发挥抗炎作用[39]。研究发现，槲皮素可以抑制病毒的复制，减轻肺部炎症，降低感染小鼠死亡率和肺指数，对感染流感病毒的小鼠亦有治疗作用[40]，同时槲皮素可通过减少氧化应激、干扰肾素-血管紧张素-醛固酮系统和下调活性氧介导的下游信号通路等方式，发挥抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎和抗病毒等药理作用[41]。汉黄芩素具有较强抑制炎症反应的作用，通过减轻流感病毒感染后的过度免疫应答反应而减轻肺组织细胞损伤，能够缓解病毒性肺炎的炎性损伤，达到治疗肺炎的作用[42]。

WikiPathways通路富集及聚类簇归属显示，治疗靶标组主要干预人体的IL-2信号通路、IL-5信号通路、胸腺基质淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin， TSLP）信号通路及抑瘤素M（oncostain M， OSM）信号通路。肺部发生感染或损伤时，引起复杂的细胞因子网络，当IL-2、IL-5等促炎因子过度释放时，形成炎性细胞爆发，毛细血管的通透性改变，致大量内毒素蛋白进入肺泡，肺泡表面被破坏，病情急剧恶化[43]。因此在治疗肺炎中，及时抑制此类促炎因子过度表达尤为重要。通过调控IL-2信号通路和IL-5信号通路减轻肺部炎症反应，从而降低肺泡上皮细胞的凋亡率，达到保护肺组织，防治肺二次损伤的作用[44]。TSLP参与炎症级联反应的启动，可以促进慢性疾病和过敏性炎症，调控TSLP信号通路，在免疫反应中起调节作用，减轻过敏，促进机体的恢复[45]。

本研究采用网络药理学方法结合UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS系统探究清肺汤治疗肺炎的物质基础和作用机制，研究结果表明清肺汤中五味子醇甲、黄芩素、6-姜酚及汉黄芩素等活性成分作用于MAPK3、EGFR、LCK信号通路的IL-5、IL-2和TSLP等关键靶标，发挥调节免疫、抗炎、调节细胞凋亡、抗病毒感染和改善肺纤维化的作用，从而起到治疗肺炎的作用。本研究初步探明经典名方清肺汤治疗肺炎的物资基础和作用机制，为经典名方的新药开发奠定了基础。

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〔基金项目〕河北省自然科学基金项目（H2022329003）。

〔通信作者〕*李" 挥，男，博士，研究员，硕士研究生导师，E-mail：lihui7171@163.com;刘永利，男，硕士，主任药师，硕士研究生导师，E-mail：liuyongli2008@126.com。