柴胡植物新品种DUS测试指南的研制
2024-11-05何龙娇孙哲樊阿梅杜晓蓉李澳旋李佳杰宋芸乔永刚
摘要：柴胡（Bupleurum chinense DC.）为伞形科柴胡属多年生草本植物，以根入药。柴胡生产中种质混杂较为严重，新品种选育势在必行。为完善柴胡植物新品种特异性、一致性和稳定性（Distinctness，uniformity and stability，DUS）测试指南，本试验收集了22份不同产地柴胡，对二年生与三年生柴胡基于形态学性状开展了DUS测试指南的研制，与原指南相比，增加了根的产量与含量相关的性状，最终确定了41个测试性状，其中包括24个必测的基本性状，17个选测性状；有质量性状0个、假质量性状15个和数量性状26个；涉及到植株性状6个、茎性状4个、叶性状7个、基生叶性状7个、花性状6个、根性状10个、生育期性状1个。本指南为我国柴胡性状测试、新品种的授权提供了支撑，对柴胡新品种选育具有重大意义。
关键词：柴胡；DUS；性状
中图分类号：S567.79 文献标识码：A 文章编号：1007-0435（2024）10-3121-12
Development of DUS Test Guide for New Bupleurum Chinense Varieties
HE Long-jiao1#， SUN Zhe1#， FAN A-mei1， DU Xiao-rong1， LI Ao-xuan1， LI Jia-jie3， SONG Yun1，2， QIAO Yong-gang1，2*
（1. College of Life Sciences， Shanxi Agricultural University， Taigu，Shanxi Province 030801， China; 2. Shanxi key lab.for Modernization of TCVM， Taigu， Shanxi Provinc 030801， China; 3. College of Traditional Chinese Medicine， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 301617， China）
Abstract：Bupleurum chinense DC. is a perennial herb of the genus Bupleurum in the Umbelliferae family，and its root can be used as medicine. The germplasm is seriously mixed in the production of Bupleurum chinense，and it is imperative to breed new varieties. In order to improve the DUS （Distinctness，uniformity and stability） test guidelines for Bupleurum chinense，22 samples of Bupleurum chinense from different habitats were collected in this study. The DUS test guidelines for 2-year-old and 3-year-old Bupleurum chinense were developed based on morphological traits，and the traits related to yield and content were added to prepare a more complete draft of DUS test guidelines for Bupleurum chinense medicinal plants in contrast to the original guidelines. A total of 41 traits were selected as the test traits of the DUS test guide for Bupleurum chinense，including 24 basic tested traits and 17 selected traits;there were 0 quality traits，15 false quality traits and 26 quantitative traits. It involved 6 plant traits，4 stem traits，7 leaf traits，7 basal leaf traits，6 flower traits，10 root traits，and 1 growth period trait. This guideline improves the lack of some traits and effective components in the DUS test guideline of Bupleurum chinense，which is of great significance for the breeding of new varieties of Bupleurum chinense in the future.
Key words：Bupleurum chinense；DUS；Characteristics
收稿日期：2024-02-23；修回日期：2024-04-06
基金项目：山西省基础研究计划自然科学研究面上项目（20210302123390）；山西省现代农业中药材产业技术体系项目（2024）；山西农业大学科技创新提升工程项目（CXGC2023041）资助
作者简介：
#何龙娇（2000-），女，汉族，山西运城人，硕士研究生，主要从事药用植物遗传学研究，E-mail：3219915173@qq.com；#孙哲（1997-），男，汉族，山西河津人，硕士研究生，主要从事药用植物遗传学研究，E-mail：297093122@qq.com；*通信作者Author for correspondence，Email：sxndqyg@126.com
柴胡是伞形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根［1］，具有镇痛、抗炎抗氧化［2］、抗抑郁［3］、保肝、抗肿瘤、免疫调节等药理作用［4-5］。柴胡皂苷为柴胡主要活性成分，具有抗炎、抗癫痫、抗肿瘤和护肝等功效［6-7］。目前，在柴胡中已发现了超过75种柴胡皂苷［8］，含量较高的皂苷包括皂苷a（SS-a）、皂苷b（SS-b）［9］、皂苷c（SS-c）、皂苷d（SS-d）、皂苷e（SS-e）和皂苷f（SS-f）［10］。2020版《药典》规定柴胡皂苷a（saikosaponin a，SSa）和柴胡皂苷d（saikosaponin d，SSd）在柴胡中的总量必须大于等于0.30%［11］。
植物新品种的特异性（distinctness）、一致性（uniformity）和稳定性（stability）（简称DUS）是授予植物新品种权的重要依据［12］。我国育种工作者选育出多个柴胡新品种，贾和田等［13］选育了‘冀柴1号’；李玉春等［14］经过系统选育、杂交育种培育出‘济柴1号’。在新品种选育、认定和保护过程都需要用到DUS测试指南，已发布实施的柴胡DUS测试指南存在植株生长年限不明确［15］、测试性状不全面和化学成分相关性状缺失的问题，为了更好地鉴定与评价柴胡种质，急需对柴胡DUS测试指南进行补充与完善。
本试验以22个不同产地的柴胡种质为材料，通过对二年生和三年生柴胡植株性状以及主要化学成分性状的观察与测量，确定了数量性状的分级标准，对质量性状与假质量性状赋代码，通过补充完善形成了针对二年生与三年生柴胡的DUS测试指南，为柴胡的新品种的选育与保护提供DUS测试依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
本研究收集22份不同产地柴胡的栽培种质包括山西、陕西、甘肃、河北多个地区，22份柴胡种质详见表1，其中二年生柴胡共214株，三年生柴胡共197株。
1.2 DUS测试指南研制依据
根据我国《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则》（GB/T19557.1）的要求［16］，综合分析我国柴胡属植物分类的相关技术与方法，植物便于直接观测的表型形态特征作为优先选择的性状，辅测性状主要有生理性状、化学成分等。
1.3 田间试验
2020年6月，将收集到的22份柴胡种子种植在山西农业大学申奉柴胡种质资源圃（北纬37°25′，东经112°25′），二年生植株性状于2021年7-8月柴胡进入盛花期后开始测量，采用5点取样法，每个点观测2株样本，每个样本的观测部位取样数量为1，在田间对柴胡植株进行地上部分形态特征的观察，观测完地上性状后对其进行挂牌标记，11月地上部分枯萎后对其取根进行地下性状的测量。三年生植株性状于2022年7-8月将其整株挖出开始测量，方法同二年生。柴胡植株各生育时期及代码见表2。
1.4 性状检测方法
柴胡地上部分性状检测方法：株高为植株基部到花序顶部的长度，在测量时对植株进行扶正，使用卷尺测量；叶的性状均为观测植株主茎中部叶片的性状，基生叶测量时选取最大的叶片进行测量，其中叶长、叶宽采用直尺测量；茎的性状均为观测植株主茎距离地面第10节茎的性状，茎粗用游标卡尺测量，节间长用直尺测量；花的性状均为观测植株主茎最顶端的花。叶形、叶尖形状、叶色、茎的颜色等性状为假质量性状，采用统一标准目测进行记录。
地下性状测量方法：根长为主根的长度（没有主根的测量其最粗的根的长度），使用直尺进行测量，根粗测量部位为芦头下方1 cm处的粗度，使用游标卡尺进行测量，鲜重为根去除泥土之后的重量，干重为鲜重烘干水分后的重量，均使用电子天平进行称量，根色使用比色纸进行比对。
柴胡皂苷含量参照2020版《中国药典》的方法进行测定［17］。
1.5 标准品种的选择
选择性状稳定的品种作为标准品种［18］，对所有的种质性状赋代码值，筛选性状最为均一的种质，将该种质的该性状作为标准性状。
1.6 数据统计与分析
通过Excel计算出各数量性状的最小值、最大值、平均值和标准差，参照褚云霞等［19］的方法对各数量性状进行分级，分级数是根据中值和级差而确定的。特异性与一致性的判断通过统计分析数量性状数据标准差（S）和变异系数（CV），稳定性可通过分析柴胡两个相同独立生长季节表型性状的分布情况得出，其数据统计采用t检验［20］。
其中：极差=最大值－最小值；
级数1=极差/（标准差平均值×2）；
级数2是级数1按照1、3、5、7、9的就小取值；
级差=极差/级数2。
式中，X为第j个性状第i个植株的观测值，x-为第j个性状的平均值，n为每个性状观测的样本量。
2 结果与分析
2.1 测试性状的选择与确定
通过查阅资料与田间实际观察，初步选定了45个性状作为柴胡DUS测试的候选性状。在将观测不便、极易受环境影响、难以描述、相关性强的性状删除后，筛选出41个性状（表3），包括24个必测的基本性状，17个选测性状。其中有质量性状0个、假质量性状15个和数量性状26个；涉及到植株性状6个、茎性状4个、叶性状7个、基生叶性状7个、花性状6个、根性状10个、生育期性状1个。
2.2 数量性状的描述与分级
2.2.1 二年生柴胡植株数量性状的描述与分级 22个产地的二年生柴胡植株数量性状的变异系数分布在14%～63%之间，性状27（花：小苞数量）变异系数小于15%，其余性状变异系数均大于15%，表明各性状种间差异大。根的分支数、鲜重、干重以及柴胡皂苷含量的变异系数均大于50%，柴胡皂苷d<柴胡皂苷a<根分支数<根干重<根鲜重，表明柴胡根部性状种间差异极大，详见表4。性状4，5，8，9，15，16，22，23，25，29，30，33分成3个连续分布的分级范围；性状2，3，6，17，26，27，34，35，36，37，38，39，40分成5个连续分布的分级范围；性状24分成7个连续分布的分级范围，详见表5。
2.2.2 三年生柴胡植株数量性状的描述与分级 柴胡植株到盛花期基生叶绝大多数已经枯萎，将基生叶相关的所有性状去除。小苞数量在测试时仅有2株为6个，其余植株均为5个，变异系数为1%，特异性极低，在分级时将该性状去除。其他性状的变异系数分布在17%～72%之间，均大于15%，表明各性状种间差异大。植株的丛生茎，根的分支数、鲜重、干重以及柴胡皂苷含量的变异系数均大于50%，表明柴胡根部性状种间差异大，植株丛生茎种间差异极大，详见表6。性状2，4，5，8，16，25，26，29，30，33，35，36，37，39，40分成3个连续分布的分级范围；性状3，6，9，15，17，34，38分成5个连续分布的分级范围，详见表7。
2.3 假质量性状赋值
为了便于观测与记录，对假质量性状的每个表达状态进行赋代码。根据实际观察情况，将性状1，7，10，11，12，14，18，19，20，21，28，41分为3个类别，将性状13与32分为4个类别，性状31分为7个类别。
2.4 标准品种的选择
植物DUS测试指南需要标准品来进行参考，以减少不确定因素引起的差异。通过对22个产地柴胡性状数据的整理，找出表达稳定的产地的性状作为标准性状。选定CH3为性状1收敛型的标准性状，CH6为松散型的标准性状；选定CH20为性状2中的标准性状；CH4为性状6中的标准性状；CH13为性状10光滑的标准性状；CH8为性状11深的标准性状；CH1为性状13线性的标准性状；CH3为性状13线状披针形的标准性状；CH9为性状14等于1的标准性状；CH11为性状15短的标准性状；CH11为性状18深的标准性状；CH3为性状20短的标准性状；CH4为性状26中的标准性状；CH2为性状32中间型的标准性状；CH14为性状33少的标准性状，CH21为中的标准性状；CH18为性状34短的标准性状；CH6为性状35中的标准性状；CH11，CH8，CH6分别为性状41早、中、晚的标准性状。
2.5 柴胡DUS测试指南性状表
通过对二年生与三年生柴胡数量性状分级，假质量性状赋值及标准品种选择，绘制出柴胡植物新品种DUS测试指南性状表，详见表8。
3 讨论
我国自1999年加入国际植物新品种保护联盟（UPOV）以来，植物品种的特异性、一致性和稳定性（DUS）测试为品种保护、审定和登记等提供技术依据，在使优良种质得到较好保护的同时，也会促进种质资源开发与利用。DUS测试中表型性状描述是否足够多、详细，对品种保护也十分重要［21］。孙建军等［22］以164份紫云英为材料，通过多年种植，确定了包括生长习性、开花期、越冬性等33个测试性状。伍丰宇等［20］对56份包括商业、栽培、稳定品种的野牛草进行观测，加入花、叶性状等28个性状，较全面概括了野牛草的表型性状。育种事业以及新品种不断涌现的同时，许多现有的DUS测试部分性状不再适用。如纪军建等［23］对153份谷子新品种的14个数量性状进行分级研究，发现现有谷子测试指南中许多数量性状的分级标准不再适用；赖运平等［24］利用现有玉米DUS测试指南中的基本性状，对2020年四川省联合体区试玉米品种的表型进行多样性分析，发现其对糯玉米和甜糯型玉米的区分效果不甚理想。
本试验最初筛选了45个性状，检测中发现植株形态表型有直立型和匍匐生长型，在田间观察时，柴胡所有产地的植株均直立生长；柴胡所有的茎均为空心；柴胡的花均为黄色，颜色无明显区别，不满足特异性的要求，因此将以上4个性状删除。柴胡总皂苷包括柴胡皂苷a和d以及其他柴胡皂苷的总和，具有极强的相关性，因此删除。24个基本性状除柴胡皂苷a和d的含量为药用植物特别重要的性状外，其余性状在二年生柴胡植株和三年生柴胡植株中可直接观察或测量，均有明显的特征。
本指南与现有的柴胡与狭叶柴胡植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南（NYT 2589-2014）相比，将二年生与三年生的柴胡分开进行DUS测试指南的研制，制定不同的分级标准，在使用时更具有针对性。药用植物为经济作物，产量在生产中很重要，将柴胡的产量性状（鲜重、干重、干鲜比）列入指南，更加有利于生产中挑选高产的优质品种。近年来有部分中药材均有将产量相关的性状加入指南中，如黄芪DUS测试指南（NYT 2592-2014）［25］中包括单根鲜重、干重等性状；方明雅等［26］在菱属DUS测试指南中加入果实鲜重及干重等性状。同时本指南还加入了有效成分（柴胡皂苷a和柴胡皂苷d）含量，弥补了药用植物测试指南中化学成分的缺失，丰富了测试指南的内容，也体现了药用植物本身的特异性。本指南中所选的标准品种的性状在二年生和三年生植株中均稳定表达，更具有代表性，满足标准品种的要求。
本指南对性状的完善有利于提高柴胡DUS测试的科学性，丰富了柴胡表型性状，今后可基于表型性状对柴胡进行遗传多样性分析，促进柴胡选种育种事业的发展。如张晓娟等［27］对55个紫花苜蓿品种农艺性状和产量性状进行分析及综合评价，以提高新品种选育效率。王凤宇等［28］以590份燕麦营养器官表型性状进行遗传多样性分析，明确燕麦各性状之间的相关关系，进而为燕麦育种和种质资源创新利用提供理论依据。在国内外植物新品种保护不断发展的同时，及时发现并改进指南中存在的问题，需要广大中药材专家及育种工作者付出努力，共同推进测试指南的研制。
4 结论
本研究对22份不同产地的柴胡通过田间种植、性状调查及数据测定最终筛选确定了41个测试性状，包括24个必测的基本性状和17个选测性状，有假质量性状15个和数量性状26个，同时也筛选到了13个标准品种，完善了柴胡DUS测试指南的研制。本指南的成功研制对于提高我国柴胡新品种保护，促进选种育种事业的发展有着重要意义。
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（责任编辑 闵芝智）
