三江源地区熊蜂16S rDNA序列变异及遗传距离分析
2024-11-05张蕊冯收闫京艳梁程博马晓璇刘道鑫
收稿日期：2024-01-28；修回日期：2024-04-14
基金项目：青海省科技厅自然科学基金（2024-ZJ-925）;青海省“昆仑英才·乡村振兴人才”项目资助
作者简介：张蕊（2000-），女，汉族，陕西咸阳人，硕士研究生，主要从事传粉昆虫生物多样性保护研究，E-mail：2205159643@qq.com；#冯收（2000-），女，汉族，山东潍坊人，硕士研究生，主要从事植物保护学研究，E-mail：fengshou223@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：liudaoxin_dy2007@163.com
摘要：本研究基于16S rDNA序列对三江源地区不同熊蜂的遗传变异和系统发育关系进行了系统分析，对于深入研究三江源地区熊蜂的适应与进化及生物多样性保护具有重要意义。研究共测序获得三江源地区9个亚属17种熊蜂的21个单倍型，序列全长496 bp。碱基组成分析表明：颠换值高于转换值，变异位点（V）共159个，单倍型间存在较大的变异。结合Genbank下载的该9亚属其他39种熊蜂的16S rDNA序列，对该9个亚属的56种熊蜂进行了遗传距离和系统发育分析，结果表明：三江源地区17种熊蜂间遗传距离为0.029～0.128；亚属内平均遗传距离为0.023～0.075，亚属间遗传距离为0.057～0.102，亚属内遗传距离明显小于亚属间；通过邻接法（NJ法）和最大似然法（ML法）建立系统发育树，两树拓扑结构大致相同，三江源地区的17种熊蜂均与同亚属其他物种的亲缘关系最近。
关键词：三江源地区；熊蜂；16S rDNA；序列变异；遗传距离
中图分类号：S891 文献标识码：A 文章编号：1007-0435（2024）10-3052-10
Analysis of Bumblebee 16S rDNA Sequence Variation and Genetic Distance in the Sanjiangyuan Region
ZHANG Rui1#， FENG Shou2#， YAN Jing-yan2， LIANG Cheng-bo2， MA Xiao-xuan2， LIU Dao-xin2*
（1.College of Eco-Environmental Engineering， Qinghai University， Xining，Qinghai Province 810016， China；2.College of Agriculture and animal Husbandry， Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810016， China）
Abstract：Based on 16S rDNA sequences，the genetic variation and phylogenetic relationship of different bumblebees in the Sanjiangyuan region were studied systematically，which is of great significance to further study the adaptation，evolution and biodiversity conservation of bumblebees in the region. A total of 21 haplotypes of 17 species of bumblebees belonging to 9 subgenera were sequenced in the Sanjiangyuan region，with a total length of 496 bp. The base composition analysis showed that the transversion value was higher than the transition value，there were 159 variation sites （V），and there were large variation among haplotypes. Combined with the 16S rDNA sequences of 39 other bumblebees from 9 subgenera downloaded by Genbank，the genetic distances and phylogenetic analysis of 56 bumblebees belonging to 9 subgenera were performed. The results showed that：The genetic distances between 17 bumblebees in the Sanjiangyuan region ranged from 0.029 to 0.128;The average genetic distance within the subgenus ranged from 0.023 to 0.075，the genetic distance between subgenera ranged from 0.057 to 0.102，the genetic distances within subgenera were significantly smaller than that between subgenera;Phylogenetic trees were established by neighbor-joining method （NJ method） and maximum likelihood method （ML method），and the topological structure of the two trees were roughly the same，all 17 species of bumblebees in the Sanjiangyuan region were closely related to other species of the same subgenus.
Key words：Sanjiangyuan region;Bumblebees;16S rDNA;Sequence variation;Genetic distance
在农业生产和自然生态系统中，传粉昆虫有着不可忽视的重要作用［1］。近年来大量研究表明，由于生态系统破坏、环境污染（农药及杀虫剂的使用）、栖息地缩小甚至丧失、病毒传播以及外来物种入侵等原因，全球范围内传粉昆虫多样性急速下降，导致传粉生态网破裂，植物面临传粉限制风险，农作物产量和质量下降，对农业生产和自然生态链产生了明显影响［2-3］。
熊蜂属于昆虫纲（Insecta）、膜翅目（Hymenoptera）、蜜蜂科（Apidae）、熊蜂属（Bombus），包含15个亚属［4］，具有传粉效率高、耐高寒和飞行能力强等特点［5］，能够通过自身的体温调节保持内部生理环境的稳定以适应高原地区海拔高、气温低、温度差异大等的恶劣气候环境条件。根据目前的调查结果，北半球的高山高原地区是熊蜂主要的分布地［6］，且青藏高原是全球物种多样性最为丰富、最具研究价值的热点地区之一［7］，平均海拔为3000～5000 m。三江源地区处于青藏高原中部，占青海省区域面积的50%，植被类型以高寒草地为主［8］，气候冷凉，加之高原地区本身分布的传粉昆虫较少，熊蜂就成为高原地区最主要的传粉类群之一［9］。我国是现存熊蜂物种资源最丰富的国家，经研究发现及报道的种类达125种，占全世界已发现熊蜂种数的50%［10-12］。国内外研究学者先后对西藏［13］、云南［14-15］、浙江［16］、四川［17］、甘肃［18］、贵州［19］等地区的熊蜂资源开展了较为系统的研究和调查，但三江源地区气候条件恶劣，人口稀少，交通不便，经济条件落后，在该地区开展熊蜂调查等科学研究往往面临着诸多挑战，最终导致该地区熊蜂生物多样性研究工作的滞后。然而，三江源地区毗邻全球熊蜂多样性中心，在该地区进行熊蜂生物多样性的系统研究对进一步丰富对中国熊蜂生物多样性分布的认识和三江源地区熊蜂生物多样性的保护具有重要意义。
线粒体基因组是在线粒体内发现的小型环状染色体，具有结构相对保守、基因进化速率快、母系遗传、高拷贝数、结构简单且易获得等特点。COI，16S rDNA，Cytb，D-loop区等基因序列均可应用于生物系统发育的研究［20］，其中16S rDNA是一种重要的分子标记，常被用于物种鉴定、遗传分化、系统发育等分析中［21］。研究表明，16S rDNA在熊蜂种级阶元系统发育分析和遗传学应用中使用广泛［22］，刘霁瑶［20］利用该基因对我国的明亮熊蜂系统发育进行分析，发现复合种内极有可能存在新种，Cameron等利用该基因序列、12S rDNA及Opain对熊蜂亚属进行系统发育分析，发现分子鉴定与形态学鉴定结果一致［23］。
本研究对三江源地区9亚属17种熊蜂的16S rDNA序列进行了扩增、测序和变异情况分析，并结合Genbank数据库下载的9亚属其他39种熊蜂的39条16S rDNA序列数据，对相关亚属的遗传距离和系统发育进行了分析，以期为青藏高原三江源地区熊蜂的物种分子鉴定、遗传多样性的研究和三江源地区生物多样性的保护提供更多基础资料。
1 材料与方法
1.1 样本采集与鉴定
2019—2021年在三江源地区通过样点标记，采用样线法和网捕法采集熊蜂成虫标本。将捕获的熊蜂放入透气矿泉水瓶中，待其自然死亡后针插标本盒中阴干保存。标本采集完毕后带回实验室，使用昆虫针将熊蜂固定在昆虫标本盒中暂存，统计总数后开展标本鉴定工作。
筛选出形态完好、无损坏的样本，根据熊蜂的毛色、长度、浓密、胸腹部体节数、体型、单眼数、胸部背面和腿节、胫节有无绒毛等外部形态学特征对初筛后的样本进行进一步分类，参考相关文献、图书资料等［18，24］的检索表对样本进行分类鉴定（表1）。
1.2 DNA提取及16S rDNA序列扩增
每种熊蜂随机挑选1～3头，提取线粒体16S rDNA基因。视样品体型取其右后足或右侧后足与中足，用滤纸包裹后碾碎，用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒（上海生物工程有限公司）提取DNA。对其线粒体16S rDNA（引物：F-5′-CACCTGTTTATCAAAAACAT-3′；R-5′-TATAGATAGAAACCAATCTG-3′）［25］基因进行PCR扩增。反应体系为40 μL，其中10×Buffer（Mg2+） 5 μL，dNTPs混合物2.5 μL，正反向引物各1 μL，Tap酶0.5 μL，DNA模板1 μL，ddHO 29 μL。扩增条件为95℃预变性4 min，95℃变性40 s，59℃退火40 s，72℃延伸45 s，72℃总延伸6 min；循环45次。利用琼脂糖凝胶电泳对扩增效果进行检测，确定扩增出目标条带且无杂带后，将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行Sanger测序。利用Chromas 2对测序结果进行校对。
1.3 Genbank数据整理
根据形态鉴定结果，本研究在三江源地区共发现熊蜂17种，分属于9个亚属。为确定三江源地区的熊蜂样本相对亚属内其他物种的遗传变异情况，在NCBI［National Center for Biotechnology Information （nih.gov）］上查找9亚属所有其他国内熊蜂物种的基因序列，共计39种熊蜂39条16S rDNA序列（表2）。
1.4 数据分析
对本研究所获得的三江源地区17种熊蜂的21条单倍型序列在NCBI上进行BLAST序列比对分析，根据和同物种参考序列的比对结果进行种内比对分析，确定形态学鉴定结果是否准确。通过MEGA7.0软件对本研究所获得的17种21条序列和从Genbank下载的39种熊蜂39条序列进行比对分析种内及种间变异情况、碱基含量、碱基对组成频数及信息位点，并计算熊蜂亚属间和亚属内的遗传距离。使用DAMBE软件［26］，进行碱基替代饱和度检验。以中华蜜蜂（Apis cerana）（NCBI登录号：OP689704）为外源群在MEGA7.0软件中进行建树，通过最大似然法（Maximum likelihood，ML）和邻接法（Neighbor-Joining，NJ）建立不同种熊蜂的系统发育关系，进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 三江源地区熊蜂16S rDNA序列种内比对分析
根据同物种序列比对结果可知：B. tibeticus（H12，H13），B. sp. SJY-2019（H16）和B. branickii（H15）无同物种参考序列，三者参考序列比对的最高相似度物种分别为黑熊蜂亚属（同亚属）红束熊蜂（B. rufofasciatus/MG681144），相似度为95.23%；拟熊蜂亚属（同亚属）图氏熊蜂（B. turneri/KX791779），相似度为97.28%；拟熊蜂亚属（同亚属）崖熊蜂（B. rupestris/DQ788099），相似度为96.42%。其他14个物种与参考序列比对相似度均高于99%。整体上16S rDNA分子鉴定的结果与形态学鉴定结果基本一致，可为形态学鉴定正确性提供佐证。
2.2 三江源地区熊蜂16S rDNA序列种间变异
2.2.1 碱基含量分析 本研究通过MEGA 7.0软件对试验所采集的17种21条单倍型序列进行分析。所有16S rDNA序列经校对后，共取序列全长496 bp，碱基组成情况为：A，T，C，G平均含量分别为39.5%，38.8%，8.0%，13.7%，A+T平均含量为78.3%，C+G平均含量为21.7%（表3）。
2.2.2 碱基对组成频数分析 碱基对组成频数分析可知，转换值（si）为15%，颠换值（sv）为29%，转换与颠换比率R为0.53，颠换值明显高于转换值，主要发生转换的碱基为A和G之间，出现颠换的碱基主要为A和T之间。
2.2.3 信息位点分析 16S rDNA基因序列共有496个碱基位点，保守位点（C）共计333个，变异位点（V）共计159个，简约信息位点（Pi）119个，自裔位点（S）40个，分别占总碱基数含量的67.14%，32.06%，23.99%，8.06%。
2.2.4 遗传距离分析 经MEGA7.0软件对21条单倍型序列进行分组处理，17种熊蜂样本的遗传距离范围为0.029～0.128（表4）。最小遗传距离发生在巨熊蜂亚属内的苏氏熊蜂（B. sushkini）和越熊蜂（B. supremus）之间，最大遗传距离发生在真熊蜂亚属密林熊蜂（B. patagiatus）和假熊蜂亚属凸污熊蜂（B. convexus）、拟熊蜂亚属斯科熊蜂（B. skorikovi）和假熊蜂亚属凸污熊蜂（B. convexus）、胸熊蜂亚属盗熊蜂（B. filchnerae）和假熊蜂亚属凸污熊蜂（B. convexus）之间。
2.3 基于16S rDNA序列的不同熊蜂亚属内信息位点分析
在Genbank上筛选出9亚属内39条其他物种序列，结合17种样本熊蜂21条单倍型，共计9亚属56种熊蜂60条序列，经MEGA 7.0进行合并分析处理。利用MEGA软件分别对9个亚属所包含的不同物种基因序列进行分析，总信息位点数为496个，通过计算，得出以下各亚属内的信息位点情况（表5）。其中拟熊蜂亚属（Psithyrus）及黑熊蜂亚属（Melanobombus）变异最大，拟熊蜂亚属变异位点91个，简约信息位点50个，黑熊蜂亚属变异位点89个，简约信息位点54个。其次为假熊蜂亚属（Mendacibombus）及胸熊蜂亚属（Thoracobombus），西熊蜂亚属（Sibiricobombus）的变异最小，其简约信息位点为0个。
2.4 基于16S rDNA序列的熊蜂亚属内与亚属间距离
经MEGA7.0软件分组计算，可得亚属间遗传距离最小发生在巨熊蜂亚属（Megabombus）和地熊蜂亚属（Subterraneobombus）之间，为0.057，最大遗传距离发生在假熊蜂亚属（Mendacibombus）和胸熊蜂亚属（Thoracobombus）之间，为0.102（表6）。亚属内平均遗传距离最小发生在真熊蜂亚属（Bombus）中，为0.023，亚属内最大平均遗传距离发生在假熊蜂亚属（Mendacibombus）中，为0.075。
2.5 三江源地区熊蜂系统发育分析结果
2.5.1 碱基替代饱和度检验 经DAMBE软件分析计算，可得碱基替代饱和度指数Iss=0.235，Iss.c=0.795，P＜0.01。由于Iss＜Iss.c，P＜0.01，碱基替代饱和度为不饱和状态。同时，以遗传距离为横坐标，转换与颠换为纵坐标的碱基替代饱和度二维散点图，表明转换值和颠换值与遗传距离具有一定的线性关系（图1），具备建立系统发育树的条件。
2.5.2 基于16S rDNA的系统发育树分析 本研究基于线粒体基因16S rDNA建立了9个亚属56种熊蜂的系统发育树，以中华蜜蜂（A. cerana）为外源群，分别采用邻接法（NJ法）和最大似然法（ML法）建树（图2，图3）。由图可知，基于两种方法的系统发育树拓扑结构大致相同，除黑熊蜂亚属（Melanobombus）和胸熊蜂亚属（Thoracobombus）中部分物种亲缘关系表现特殊外，其他相同亚属物种基本聚类为同一分支，系统发育树所体现的亚属间的亲缘关系与遗传距离的对比关系相似。
3 讨论与结论
3.1 三江源地区熊蜂种间变异
样本熊蜂的21条单倍型序列碱基AT含量明显高于GC含量，存在一定的碱基偏倚性［27］。碱基组成频数中，转换主要发生在A和G之间，颠换主要出现在A和T之间，颠换值高于转换值，与前人在线粒体基因方面的研究情况一致［28-30］。16S rDNA基因序列保守位点占比约70%，变异位点占比32%，存在相对较高的保守性和一定程度的变异［31-33］。在种间遗传距离分析中，巨熊蜂亚属的苏氏熊蜂（B. sushkini）和越熊蜂（B. supremus）之间的遗传距离最小，与黄家兴基于COⅠ的系统发育研究结果一致［34］；真熊蜂亚属的密林熊蜂（B. patagiatus）和假熊蜂亚属的凸污熊蜂（B. convexus）之间的种间遗传距离最大。
3.2 亚属内和亚属间遗传距离
本研究中9个熊蜂亚属的属内变异位点数为23～91个，简约信息位点为0～54个，存在相对较大的变异，与熊蜂亚属遗传变异分析相关研究文章结果一致［20］，绝大多数物种的最小种间遗传距离均出现在该物种与同亚属的其他物种之间。黑熊蜂亚属B. tibeticus、拟熊蜂亚属B. branickii和B. sp. SJY-2019无NCBI参考序列，经分子序列比对后其相似度最高物种与遗传距离最小物种均一致，故进一步为形态学物种鉴定提供可靠证据。
3.3 系统发育
在系统发育树分析上，邻接法（NJ法）和最大似然法（ML法）两类建树分支结果大致相同，绝大多数相同亚属物种聚类为同一分支。除黑熊蜂亚属和胸熊蜂亚属为并系群外，其余熊蜂亚属均为单系群。黑熊蜂亚属中萃熊蜂（B. eximius）和白背熊蜂（B. festivus）与同亚属其他物种亲缘关系较远。其中萃熊蜂与阿熊蜂亚属和假熊蜂亚属亲缘关系较近，白背熊蜂与西熊蜂亚属亲缘关系较近。胸熊蜂亚属存在两种熊蜂亲缘关系表现特殊，黑足熊蜂（B. atripes）和仿熊蜂（B. imitator）并未和同亚属其他物种聚为一支，而与其他亚属亲缘关系更近，但分支支持率并不高。对于两亚属中个别物种与其他亚属物种亲缘关系更近的情况，目前并未有相关研究结果能够解释这一现象，有待进一步考究。个别亚属物种的亲缘关系表现异常也可能是因为数据量支持不够，属正常情况，当具备足够的数据量时结果将更加精确。本研究结果也支持了目前亚属的分类系统。系统发育分析结果与物种采集后基于形态学的样本鉴定结果一致。在置信度方面NJ法相对于ML法更高。
本研究对9亚属56种熊蜂60条序列进行序列变异分析，发现三江源地区17种熊蜂16S rDNA基因序列变异位点159个，存在一定程度的变异；在系统发育分析中三江源地区的17种熊蜂均与同亚属其他物种的亲缘关系最近，支持了它们的分类地位；绝大多数物种的最小种间遗传距离均出现在该物种与同亚属的其他物种之间。本研究结果对三江源地区熊蜂生物多样性的保护具有重要意义。
参考文献
［1］WILLIAMS P H. Phylogenetic relationships among bombus（Bombus Latr.）：A reappraisal of morphological evidence［J］. Systematic Entomology，1994，19（4）：327-344
［2］GRAB H，BRANSTETTER M G，AMON N D，et al. Agriculturally dominated landscapes reduce bee phylogenetic diversity and pollination services［J］. Science，2019，363（6424）：282-284
［3］秦加敏，苏睿，梁铖，等. 熊蜂生物学及种群影响因素研究进展［J］. 环境昆虫学报，2020，42（6）：1383-1393
［4］WILLIAMS P H，CAMERON S A，HINES H M，et al. A simplified subgeneric classification of the bumblebees （genus Bombus）［J］. Apidologie，2008，39（1）：46-74
［5］PARREY H A，RAINA R，SADDAM B，et al. Role of bumblebees （Hymenoptera：Apidae） in pollination of high land ecosystems：A review［J］. Agricultural Reviews，2022，43（3）：368-373
［6］CAMERON S A，SADD B M. Global trends in bumble bee health［J］. Annual Review of Entomology，2020，65（12）：209-232
［7］傅伯杰，欧阳志云，施鹏，等. 青藏高原生态安全屏障状况与保护对策［J］. 中国科学院院刊，2021，36（11）：1298-1306
［8］刘佩霞，王军邦，孙晓芳，等. 三江源区高寒草地植被生长的气候适宜性研究［J］. 草地学报，2023，31（10）：3145-3156
［9］梁程博，王久利，孙国，等. 三江源地区熊蜂物种多样性研究［J］. 草地学报，2022，30（8）：2126-2134
［10］黄家兴，安建东. 中国熊蜂多样性、人工利用与保护策略［J］. 生物多样性，2018，26（5）：486-497
［11］WILLIAMS P H，OSBORNE J L. Bumblebee vulnerability and conservation world-wide［J］. Apidologie，2009，40（3）：367-387
［12］AN J D，HUANG J X，SHAO Y Q，et al. The bombus of North China （Apidae，Bombus Latreille）［J］. Zootaxa，2014，3803（1）：1-89
［13］王淑芳. 西藏昆虫（第二册）［M］. 北京：科学出版社，1982：427-447
［14］杨大荣. 云南澜沧江流域传粉昆虫——熊蜂多样性现状与保护对策［J］. 生物多样性，1999，7（3）：170-174
［15］梁铖，张学文，黄家兴，等. 云南熊蜂地理区划及物种多样性分析［J］. 应用昆虫学报，2018，55（6）：1045-105
［16］於文俊，茅洪新，王冬生，等. 浙江天目山熊蜂的初步调查［J］. 上海农业学报，2003，19（4）：70-72
［17］XIE Z H，WILLIAMS P H，TANG Y. The effect of grazing on bumblebees in the high rangelands of the eastern Tibetan Plateau of Sichuan［J］. Journal of Insect Conservation，2008，12（6）：695-703
［18］安建东. 甘肃熊蜂区系组成与多样性分析［D］. 福州：福建农林大学，2012：14-122
［19］王哲哲. 贵州省野生熊蜂资源调查及分类研究［D］. 贵阳：贵州大学，2020：17-18
［20］刘霁瑶. 中国明亮熊蜂复合种鉴定及系统发育分析［D］. 北京：中国农业科学院，2021：2-37
［21］巩海强，柴继宽，陈三冬，等. 抑制黄曲霉乳酸菌的筛选与鉴定［J］. 草地学报，2023，31（2）：587-595
［22］徐龙龙，吴杰，郭军，等. 共生菌群在熊蜂生长发育过程中的动态变化［J］. 中国农业科学，2014，47（10）：2030-2037
［23］CAMERON A S，WILLIAMS H P. Phylogeny of bumble bees in the New World subgenus Fervidobombus （Hymenoptera：Apidae）：congruence of molecular and morphological data［J］. Molecular Phylogenetics and Evolution，2003，28（3）：552-563
［24］黄家兴，安建东. 中国熊蜂多样性、人工利用与保护策略［J］. 生物多样性，2018，26（5）：486-497
［25］CAMERON S A，HINES H M，WILLIAMS P H. A comprehensive phylogeny of the bumble bees （Bombus）［J］. Biological Journal of the Linnean Society，2007，91（1）：161-188
［26］XIA X H. DAMBE6：New tools for microbial genomics，phylogenetics and molecular evolution［J］. Jourrnal of Heredity，2017，108（4）：431-437
［27］HAN T，KIM S，YOON H J，et al. Genetic variations of DNA barcoding region of bumble bees （Hymenoptera：Apidae） from South Korea［J］. Mitochondrial DNA Part A，2018，30（1）：30-42
［28］吴仁协，李超，刘静. 鲳亚目鱼类线粒体16S rRNA基因序列变异及其分子系统进化关系［J］. 水产学报，2013，37（1）：16-25
［29］孙振华，郭晓华，刘广纯. 基于16S rRNA序列的鳃金龟亚科5族种类的系统发育关系［J］. 沈阳大学学报（自然科学版），2013，25（3）：177-183
［30］KNIGHT A，MINDELL D P. Substitions bias，weighting of DNA sequence evolution，and the phylogenetic positions of fea’s viper［J］. Systematic Biology，1993，42（1）：18-31
［31］王玉茹. 小绿叶蝉族分子系统发育研究（半翅目：叶蝉科：小叶蝉亚科）［D］. 杨凌：西北农林科技大学，2017：16-47
［32］杨兰. 楔缘金小蜂属分子系统发育研究初探（膜翅目：小蜂总科：金小蜂科）［D］. 保定：河北大学，2020：21-66
［33］孙艳春，孟瑞，王应伦. 基于18S rDNA和无翅基因的中国瓢蜡蝉科分子系统发育关系研究（半翅目：蜡蝉总科）（英文）［J］. 昆虫分类学报，2015，37（1）：15-26
［34］黄家兴. 巨熊蜂亚属的修订及其分子系统学［D］. 北京：中国农业科学院，2015：12-64
（责任编辑 闵芝智）
