基于粪便DNA宏条形码的人工草地放牧绵羊采食组分研究

收稿日期：2024-04-10；修回日期：2024-05-15

基金项目：宁夏回族自治区重点研发项目（2017BY082）；中国博士后科学基金面上项目（2019M660877）；国家自然科学基金重大项目（32192463）资助

作者简介：郭艳萍（1986-），女，汉族，河北邯郸人，博士，助研，主要从事草地管理、草种质资源研究，E-mail：guoyp@caf.ac.cn；*通信作者Author for correspondence，E-mail：luohailing@cau.edu.cn

摘要：准确获取食草动物食性数据有助于了解草地放牧家畜的营养状况，同时也对掌握草地植物群落的动态变化具有重要意义。本研究通过从滩羊粪便样本中提取DNA，利用ITS2条形码和粪便DNA宏条形码技术（fDNA metabarcoding），基于出现频率（Frequency of occurrence，FO）和相对序列丰度（Relative read abundance，RRA）两个指标快速分析获得粪便中的物种组成。分析获得的滩羊食物组成包含28个植物类群，主要有藜属（Chenopodium sp.）、苜蓿属（Medicago sp.）、蒿属（Artemisia sp.）等隶属于13科23属，其中27个鉴定到种水平，物种鉴定分辨率高达96%。藜属FO和RRA均最高，分别为100.0%和31.5%，其次为紫花苜蓿（Medicago sativa），分别为100.0%和26.9%。基于两种算法分析得到的食物比例具有差异性和一致性，其中紫花苜蓿是放牧滩羊的主要采食来源，但摄入比例需要校正。研究证明了基于ITS2片段的粪便DNA宏条形码技术在食草家畜快速准确食性分析中的可行性，为此类研究提供了有力借鉴。建议采用该技术时应完善潜在摄食植物DNA条形码数据库，准确分析目标家畜在特定区域内的采食种类。

关键词：绵羊；食性；DNA宏条形码；ITS2;物种鉴定

中图分类号：S541 文献标识码：A 文章编号：1007-0435（2024）10-3043-09

Fecal DNA Metabarcoding-based Diet Composition Research of Grazing Lambs on Artificial Pasture

GUO Yan-ping^1，2， WANG Yue-jun¹， PENG Si-jia¹， ZUO Shu-xian¹， ZHANG Ying-jun³， LUO Hai-ling^1*

（1. State Key Laboratory of Animal Nutrition and Feeding， College of Animal Science and Technology， China Agricultural University， Beijing 100193， China; 2. Research Institute of Forestry， Chinese Academy of Forestry， Beijing 100091， China; 3. College of Grassland Science and Technology， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract：Acquiring accurate dietary composition information of herbivores is a valuable tactic in understanding their nutritional level and the function of the grassland ecosystem. This study collected Tan lambs fecal samples from three treatment groups：artificial pasture grazing（G），artificial pasture grazing with the indoor feeding group （GF），and the indoor feeding group （F）. DNA was then extracted from the samples and the species were identified based on the ITS2 gene and DNA mebarcoding technique. Frequency of occurrence （FO） and Relative read abundance （RRA） were used to determine the diet composition. Using fecal DNA metabarcoding，we conducted diet analysis for the lambs and found 28 different plant operational taxonomics unites （OTUs） belonging to 13 families and 23 genera，of which 27 were identified to the species level，and the species identification resolution was 96%. The predominant categories were Chenopodium sp.，Medicago sp.，and Artemisia sp.. Chenopodium sp. had the highest relative FO （100.0%） and RRA （31.5%） among all the ingested foods，followed by Medicago sativa （100.0% and 26.9%，respectively）. Therefore，to some extent the proportion obtained by frequency of occurrence and relative read abundance showed consistent tendencies but also generated differences. The results revealed that M.sativa was the main diet component of lambs，however its accurately proportion needs further correction. In addition，we suggested that the usage of fecal DNA barcode analysis approach should consider feeding range，targeted herbivores，and improved barcode database，which favorable to accurately determination of species and ingestion proportion. Our study highlights the utilization of fecal DNA metabarcoding based ITS2 gene in fast and high-throughput diet analysis，and provides a technical guidance for future herbivore livestock nutrition surveys and food-web studies.

Key words：Sheep;Diet analysis;DNA metabarcoding;ITS2;Species identification

食草家畜食性研究是掌握草地放牧家畜营养状况的基础，也是监测草地植物群落动态变化的重要载体，对于开展草地精细化管理、家畜高效饲养策略、畜产品提质增效等具有重要意义^［1-2］。准确获取放牧家畜的采食组分及采食量，是探究放牧家畜生长水平及其差异性形成原因的关键，同时也能反映出其选择性采食对草原生态系统结构与功能的影响^［3］。然而放牧家畜的牧食行为较为复杂，采食数据获取难度大^［4］。传统的草食家畜食性研究方法有很多，主要包括模拟采食法、牧草采食法、食道瘘管法、瘤胃内容物法、粪便显微分析法、植物蜡层指示剂法和近红外光谱法等^［5-7］。

自90年代以来，以饱和链烷为代表的植物蜡层指示剂法使用范围最广^［8-14］。牧草中的链烷、长链脂肪酸和长链醇以及其他碳同位素组分可以作为“植物指纹”来直接估测放牧家畜的0uv8M8yxVYMJVCErQ9WqF2Jz8NXVU7ANwUAd0VzadhU=采食成分及采食量，对日粮组成简单的家畜食谱的估测结果准确可靠^［15-16］。尽管该方法具有准确度高、低成本、易操作、非损伤性采样等优点，但如果饲草中的链烷浓度较低，或者物种间链烷模式相似时，随着自由采食家畜的食物组分复杂化，准确性会明显下降，而且植物饱和链烷的浓度模式会因季节波动差异较大，需要在不同季节反复取样监测，过程繁琐，这也是植物蜡层成员的共有缺陷。

伴随着分子生物学研究的逐步深入和高通量测序（High-throughput sequencing，HTS）技术的快速发展，粪便DNA宏条形码技术（fDNA metabarcoding）的出现为动物食性研究提供了一种更高效、更准确的手段^{［2，17-19］}。DNA宏条形码是利用高通量测序手段获得样本中多个物种DNA条形码片段，通过生物信息学手段实现物种鉴定的技术^［20］。该技术不受物种的个体形态及发育时期限制，对于高度降解的食物残渣敏感性高，能够快速获取更高通量的物种信息，同时也避免了传统方法的主观误差^［21-22］。目前，该技术已广泛应用于食草动物和食肉动物的食性研究领域中，如软体动物^［23］、节肢动物^［24］、爬行动物^［25］、鸟类^［26］和哺乳动物^［27-28］等。

滩羊作为宁夏优质绵羊品种，因其肉质鲜嫩、膻味小、风味独特而深受消费者喜爱。随着滩羊市场需求的加大和缓解天然草场放牧压力的客观需求，养殖模式逐渐由传统的天然草场放牧向规模化舍饲或人工草场放牧转变。前期研究发现不同饲养方式会影响羊肉的色泽、口感及营养成分^［29］，然而采食组分摄入与滩羊肉品质形成之间的关系尚不清晰。本研究以滩羊粪便为实验材料，利用DNA宏条形码技术探讨其食物组成，为开展不同饲养方式下滩羊采食组分差异研究提供方法基础，进而为滩羊精准营养和实现健康养殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验点概况

试验样地为人工混播草地，位于宁夏回族自治区固原市原州区头营镇马园村（106°26′E，36°14′N，平均海拔1600 m）。样地设置4个放牧小区，面积为516 m²。混播草地种植紫花苜蓿（Medicago sativa）、草地早熟禾（Poa pratensis）、草地雀麦（Bromus riparius）的组合比例为15%，35%及50%，亩播量为4.5 kg。

1.2 试验动物及饲养管理

饲养试验于2019年7—10月进行。选择体重（19.76±0.29）kg相近的3月龄断奶滩羊公羔33只，随机分为3组，每组11只。试验设置3个处理组，分别为舍饲组（F）、人工草场限时放牧补饲组（GF）和人工草场放牧组（G）。F组每天饲喂两次，时间分别为7：30和17：30，并保证活动时间1～2 h；GF组每天7：00—11：00进行放牧，归牧后进行补饲，试验日粮同舍饲组；G组每天7：00—19：00进行放牧，不补饲。G组和GF组的滩羊采取轮牧形式，放牧试验结束后，所有羊只归圈。饲养试验期间自由饮水。试验日粮依据NRC（2007）肉用绵羊的营养需求，按照体重30 kg，日增重200 g的标准进行配制，日粮配方及营养水平详见表1所示。

1.3 样品采集和保存

分别从3个处理组中随机挑选5只羔羊用于采集新鲜粪便样品。具体采集方法为：采样期间，滩羊在归牧后单独置于围栏内，并在栏底铺上干净塑料布，在次日清晨饲喂或放牧之前收集粪样，并迅速置于-20℃保存。将连续收集三天的新鲜粪便样本均匀混合为15份，置于-20℃冰箱低温保存，用于后续分析采食组分。

1.4 粪便DNA提取和PCR扩增

将采集的粪便样品迅速粉碎，称取200 mg放入2 mL微量离心管内，将离心管置于冰上。使用粪便基因组DNA提取试剂盒（Omega Biotek，Norcross，GA）提取滩羊粪便总DNA，提取方法参考试剂盒详细说明。将所得DNA溶液收集到离心管后，-20℃保存。

以上述DNA为模板，基于文献报道^［30］和前期研究^［31］，选用引物对rD5-ITS2（5′-barcode-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和rb1-ITS2f （5′-CGATACTTGGTGTGAATTGCAG-3′）进行粪便中植物DNA核基因ITS2片段的扩增，扩增片段长度约为350 bp。在引物5′端增加由8个特异性碱基序列组合而成的“barcode”标签，扩增同一样品的一对引物使用相同标签，以区分后续混合样品高通量测序结果中的序列来源。

PCR扩增体系为20 μL，包括样品DNA 10 ng dNTPs （2.5 mmol·L^-1） 2.0 μL，5×FastPfu buffer 4.0 μL、5×FastPfu聚合酶0.4 μL，正反引物各0.8 μL （5 μmol·L^-1），牛血清蛋白（BSA）0.2 μL，ddH2O补充至20 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，59℃退火60 s，72℃延伸60 s，循环45次；72℃延伸10 min。

1.5 高通量测序和数据处理

PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带大小，用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行纯化，应用QuantiFluor-ST （Promega，U.S.）进行定量，将扩增子等量混合，构建文库，使用Illumina MiSeq PE300平台完成双端测序（Paired-end sequencing），由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

测序完成后，用QIIME（version1.17）软件对原始fastq文件进行严格的过滤和质控处理，并形成一个新的带有标签的序列文件。使用Usearch软件，按照97%相似性对序列进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类，过程中使用UCHIME软件识别并去除嵌合体序列，得到OTU代表序列。将所有优化序列匹配至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。

对OTU进行多样性分析，以评估测序结果。利用MOTHUR（version1.30.1）软件进行物种覆盖程度和Alpha多样性分析，包括Good′s coverage指数、物种丰富度估计（Chao，ACE），物种多样性统计（香农指数Shannon index、辛普森指数Simpson index）。利用QIIME程序进行主成分分析（Principal-component analysis，PCA），用R语言（version3.2.1）中的VEGAN程序包绘图。

利用Blastn工具，将上述OTU代表序列与NCBI中的NT数据库进行比对，获得每个OTU的物种注释。按照序列同源性最高原则，对每一个代表性OTU序列进行分类学注释。同时需要综合考虑其他因素，结合本地物种分布信息，如匹配物种所在特定地域的多样性，对物种进行最终注释，确保结果可靠^［33］。物种注释的原则为：在种水平上，相似性阈值设定为不低于95%；最匹配序列只对应到单一植物物种，若该物种在当地有分布，则认定序列属于该物种；最匹配序列对应到多个物种时，首先考虑排除在当地无分布的物种，若仍对应两种以上，则在更高分类单元水平上（属或科水平）对该序列进行分类注释。

1.6 采食数据分析

进一步对注释后的植物类群进行筛选与整理，从OTU表格中剔除真菌及动物自身的干扰序列，去除占比小于0.1%的序列，统计每份样品中食物种类及其对应的序列条数，然后进行采食组分分析。用出现频率（Frequency of occurrence，FO）和相对序列丰度（Relative read abundance，RRA）两个指标估计滩羊羔羊的食性构成^［34］。

FO是含某一植物类别的样品数占总样品数的百分比，计算公式如下：

式中，N表示出现i类食物的样品数，N是有效样品总数。当一份样品中存在一种以上食物时，全部食物类别的FO之和大于100%。

RRA是某一植物类别的序列数在该样品总植物序列的百分比，反映了相对生物量，计算公式如下：

式中，T是植物类别数，N是有效样品总数，S是植物类别i在样品j中的序列数。由公式可知，全部食物类别的RRA之和为100%。

2 结果与分析

2.1 原始测序数据的数据量和测序质量

本研究从人工草场放牧组、限时放牧补饲组、舍饲组三个处理组中共采集滩羊粪便样品15份，ITS2目标区域全部扩增成功。15份宁夏滩羊粪便样品PCR产物高通量测序结果表明，所有样品均扩增到有效的食性数据。通过对原始测序数据进行过滤、质控之后，共收集到1 401 086条有效ITS2基因序列（valid sequences），每份样品中含有的平均序列数为93 406条（70 046～121 613条），序列平均长度为315 bp。

本试验中，在97%相似度水平进行聚类分析共获得835个OTUs。采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU有效代表序列进行分类学统计分析，然后在各个水平分析滩羊粪便中物种多样性和丰度指数等主要指标。通过对Good’s coverage指数分析，数据显示各个样本的测序覆盖率均超过了99%以上，说明本次研究测序的ITS2有效序列代表了各个样本99.9%以上的物种种类，足以覆盖滩羊粪便中饲粮情况。

2.2 基于OTU水平的多样性分析

对舍饲对照组（F）、限时放牧补饲组（GF）与放牧组（G）粪便样本中的植物群落丰富度及多样性指数进行了比较分析（表2）。结果表明，三组样本检测到的OTU丰富度（Chao指数）没有显著差异。然而，三组粪便样本之间的群落多样性包括Shannon指数和Simpson指数具有显著差异（P<0.01）。如图1所示，通过Shannon指数组间差异分析发现，滩羊改变日粮组成后，粪便植物种群多样性降低，放牧比舍饲的物种多样性明显减少（P<0.05）。

图2不同颜色图例分别代表不同饲养模式滩羊的粪便样本。通过PCA分析发现，三个不同饲养模式滩羊的粪便样本植物群落组成具有明显差异，说明植物群落随滩羊日粮组成的变化而呈明显的梯度变化，舍饲组（F）和放牧组（GF和G）的群落组成具有明显差异。PC1轴和PC2轴对结果的解释度分别为42.53%和27.34%。

2.3 滩羊食物组成

对15份粪便样品中的ITS2有效食性数据进一步人工筛选和处理，去除序列占比小于0.1%的物种，并剔除真菌和动物自身的干扰序列，剩余有效序列注释后共鉴定出的牧草隶属于13科23属28种不同的物种类别，其中27种鉴定到种水平，1种鉴定到属水平（表3和表4）。13种科分别是豆科（Fabaceae）、苋科（Amaranthaceae）、菊科（Asteraceae）、大麻科（Cannabaceae）、锦葵科（Malvaceae）、蓼科（Polygonaceae）、茄科（Solanaceae）、禾本科（Poaceae）、唇形科（Lamiaceae）、蔷薇科（Rosaceae）、大戟科（Euphorbiaceae）、十字花科（Brassicaceae）、桑科（Moraceae）。23种属分别是藜属（Chenopodium L.）、苜蓿属（Medicago L.）、蒿属（Artemisia L.）、向日葵属（Helianthus L.）、驴食豆属（Onobrychis L.）、大麻属（Cannabis L.）、苋属（Amaranthus L.）、棉属（Gossypium L.）、蓟属（Cirsium L.）、萹蓄属（Polygonum L.）、茄属（Solanum L.）、玉蜀黍属（Zea L.）、甘草属（Glycyrrhiza L.）、百里香属（Thymus L.）、酸模属（Rumex L.）、毛莓草属（Sibbaldianthe L.）、大戟属（Euphorbia L.）、天仙子属（Hyoscyamus L.）、锦葵属（Malva L.）、车轴草属（Trifolium L.）、芸薹属（Brassica L.）、桑属（Morus L.）、漏芦属（Rhaponticum L.）。它们在所有样品中总序列数为350，542条，占全部序列的74.99%，在NCBI GenBank数据库中的最高一致度（Identity）均为99%以上。

测序结果发现，藜属和苜蓿属是源于滩羊粪便中最主要的牧草类别，RRA分别为31.5%和26.9%。此外，蒿属也在滩羊粪便中占有较高的比例，RRA为17.4%。同时，向日葵属、驴食豆属、大麻属、苋属等在滩羊粪便中占了较小的比例。各食物类别的FO和RRA存在显著差异。图3是舍饲组（F）、限时放牧补饲组（GF）和放牧组（G）滩羊粪便中的植物组成结果。可以看出，与舍饲组相较而言，放牧组的植物物种构成更为简单。

3 讨论与结论

3.1 ITS2片段用于物种鉴定

得益于分子生物学研究的进步，目前基于粪便DNA获悉食物组成已成为食性研究领域的主流方法^［35-36］。本研究使用植物ITS2基因作为识别植物物种的条形码，共鉴定出28个植物类群（0.1%以上）。其中27个鉴定到物种水平，种水平鉴定成功率达到96%。仅鉴定到属的1个类别为蒿属，猜测该条形码在蒿属中的种间差异较小，物种分辨度有限，与在我国典型草原开展的蒙古绵羊食性鉴定研究结果类似^［31］。说明本研究所用的ITS2区域通用引物rD5-ITS2/rb1-ITS2f并不是对所有植物类群都有效，因此需要对引物是否充分覆盖研究区域潜在摄食物种进行深入研究。

豆禾混播草地主要组分为紫花苜蓿、草地雀麦和草地早熟禾。紫花苜蓿序列在滩羊粪便中的相对丰度为26.9%，位居第二，然而两种禾本科牧草并没有成功鉴定出来。原因可能是存在基因优先扩增现象，非禾本科植物更容易被优先扩增^［30］。本次研究中禾本科鉴定成功率较低的另一个原因可能是粪便样品保存不当引起的DNA降解。目前最新的基于粪便DNA的动物食性研究中，多采用两步法进行样品保存，即采集的新鲜粪便先经无水乙醇浸泡24 h，再加入硅胶置于-20℃保存^［37-38］。经两步法处理后，能从粪便中获取更高浓度的DNA，PCR扩增实验中的成功率也更高^［39］。本研究采集的新鲜粪便样品直接置于-20℃低温保存，可能一定程度上会影响DNA提取和目标条带的扩增效果，导致鉴定成功率降低。综合目前研究，如需对家畜所采食种类进行更精确的判定，一方面通过优化保存方法避免样品降解，另一方面需要考虑引入其他引物进行后续扩增及测序分析。此外，条形码数据库内物种序列信息的完备程度也将影响鉴定结果的准确性。

3.2 采食组成

以往关于动物尤其食肉动物的食性研究报道中，通常用应用食物出现频率FO这一指标来定性描述动物的食性构成。本研究结果显示，利用食物出现频率FO和相对序列丰度RRA得到的食性结果差异较为明显（表3和表4）。比如，桑属植物其FO高达80.0%，而RRA仅为0.1%。这是由于FO反映的是某一食物组分出现的频次，因此会增加生物量贡献较低的食物类别所占的比例。而RRA利用食物扩增序列数与原始生物量组成相关的关系，反映了相对生物量，更加接近食物的实际生物量，对高通量食性分析提供了更多信息，潜在应用价值更大。

然而，从我们的研究结果中也发现，利用RRA描述家畜的食物组成存在一定误差。就舍饲组而言，根据其日粮配方可知，苜蓿（苜蓿干草和苜蓿草粉）所占比例为35.0%，而通过高通量测序获得的相对比例为25.5%，低估了9.5%。玉米（玉米秸秆和玉米颗粒）所占比例为40.25%，而测序后的相对比例仅为0.5%，低估了39.75%。分析原因，除了动物本身对不同属种牧草的消化率存在差异外，还有一个误差可能是因为ITS2条形码的通用引物对于不同类群的牧草扩增效率不同。本研究团队之前的动物实验也发现，ITS2基因的通用引物更倾向于扩增非禾本科植物，从而会导致禾本科植物的相对比例被低估。建议可以从两个方面继续开展研究：首先，通过饲喂控制试验构建定量校正模型，对目标牧草类群的估测比例进行二次校正，对采食组分估测结果加以修正完善。另外有研究证明，相比于单基因片段，复合条形码组合能够明显提高物种的鉴别效果。因此，可以通过引入组合条形码，例如ITS2 + trnH-psbA，matK + rbcL，提高对禾本科植物的鉴别效率。但是要面临测序成本增加、测序数据更加复杂的挑战。

综上，本研究初步利用基于核基因ITS2片段的粪便DNA宏条形码技术，对放牧滩羊的粪便进行高通量分子食性分析，表明该条形码的物种分辨率高达96%，且验证紫花苜蓿是滩羊的主要食物来源之一。未来可结合饱和烷烃法等经典方法，对测序结果加以分析与校正，为粪便DNA宏条形码技术在家畜食性鉴定中的应用提供依据。

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（责任编辑 刘婷婷）